外显子组测序在皮肤肿瘤中的研究进展

曾明凤 康晓静

外显子组测序在皮肤肿瘤中的研究进展

曾明凤 康晓静

皮肤肿瘤发病率有逐年上升趋势，环境因素和遗传易感性是皮肤肿瘤的主要致病因素。基因突变与皮肤肿瘤的发生、发展密切相关，为阐明皮肤肿瘤的发病机制提供线索。在黑素瘤、皮肤鳞状细胞癌、皮肤基底细胞癌等皮肤肿瘤中，已发现众多新的突变基因。外显子组测序作为筛查易感基因的有效平台，覆盖率深、数据准确性高，可以检测皮肤肿瘤及其他多种疾病的致病基因和新的候选基因，对皮肤肿瘤的诊断、治疗及预后判断有重要意义。

皮肤肿瘤；外显子组；多位点测序分型；基因；突变

1 在黑素瘤的应用

黑素瘤在皮肤肿瘤中恶性程度高，2013年美国有 9 480 例患者死于该病［2］。2010 年，Pleasance 等［3］第一次对黑素瘤行全基因组测序，提供了肿瘤基因组体细胞突变谱。Wei等［4］为寻找黑素瘤新的候选基因，于2011年第1次将外显子组测序应用于黑素瘤研究，得到综合的外显子区变异结果。作者发现，大多数黑素瘤的突变基因位于谷氨酸信号通路，而修饰谷氨酸信号通路可以抑制肿瘤生长。除BRAF突变外，他们在这项研究中还检测到TRRAP和GRIN2A突变。TRRAP具有乙酰转移酶活性，编码转化/转录域相关蛋白。该研究的167例黑素瘤样本中有6例发生TRRAP突变（4%），该突变发生于高度保守区域，使722位丝氨酸变为苯丙氨酸。用shRNA干扰突变的TRRAP基因表达，发现黑素瘤细胞凋亡率增加，提示TRRAP可能是一新的致癌基因。GRIN2A位于染色体16p13.2，编码N-甲基-D-天冬氨酸受体。N-甲基-D-天冬氨酸受体是一类离子型谷氨酸受体，有谷氨酸受体激动剂结合位点。GRIN2A在黑素瘤样本中的突变频率为25.2%，为本研究中突变频率最高的基因。有学者在其他外显子组测序研究中也发现相似的GRIN2A突变频率［5-7］。另有研究表明，黑素瘤患者中有GRIN2A突变的较无GRIN2A突变的疾病进展更快，总生存期更短，提示有无GRIN2A突变可能是判断黑素瘤患者预后的一个指标［8］。

阻断黑素瘤中有GRM3突变的MEK信号通路是治疗黑素瘤的新靶点。GRM3是G蛋白耦联受体的家族成员，Prickett等［9］利用外显子组测序在黑素瘤中检测出GRM3突变，80例黑素瘤样本中，有13例检测到18个GRM3非同义突变，突变率为16.3%。同时他们分析另57例标本，确定GRM3突变热点在p.Glu870Lys。此研究结合GRM3高频突变率及系统的功能验证分析，提示GRM3为黑素瘤发生的驱动基因。GRM3突变激活MEK信号通路，促使黑素瘤细胞增殖和迁移。由此提示阻断黑素瘤中GRM3突变导致MEK信号激活可为治疗黑素瘤提供新方法。

葡萄膜黑素瘤是成人眼内最常见的恶性黑素瘤，其主要特征为易发生远处转移，有研究显示，约一半的患者会发生转移。癌基因GNAQ突变在葡萄膜黑素瘤中很常见，但GNAQ突变通常发生于肿瘤形成早期［10］。2010 年，Harbour等［11］使用外显子组测序在葡萄膜黑素瘤中检测出BAP1失活性突变，研究表明，BAP1突变发生在葡萄膜黑素瘤进展晚期及转移性葡萄膜黑素瘤中，BAP1可能是未来治疗葡萄膜黑素瘤的靶标。

葡萄膜黑素瘤发生转移与一条3号染色单体的缺失有关，3号染色体正常的葡萄膜黑素瘤很少发生转移，有部分单体3号染色体的葡萄膜黑素瘤预后好。Martin等［12］通过外显子组测序，在葡萄膜黑素瘤中检测到EIF1AX和SF3B1基因频发突变，检测的3例SF3B1突变组织中，2例在Arg625发生杂合错义突变。已有研究表明，葡萄膜黑素瘤SF3B1突变发生在Arg625位的预后好［13］。他们通过Kaplan-Meier方法分析，显示有SF3B1和EIF1AX突变的葡萄膜黑素瘤相比没有这些突变基因的葡萄膜黑素瘤预后好。上述研究为葡萄膜黑素瘤的预后、转移风险评估提供依据。

SOX10基因在葡萄膜黑素瘤的发展中起作用。2014年，Das等［14］利用外显子组测序在印度葡萄膜黑素瘤患者中检测到一新的突变基因，位于4号外显子的SOX10。转录因子SOX10，位于小眼球相关转录因子上游，与小眼球相关转录因子起协同作用［15-16］。

2 在皮肤鳞状细胞癌（SCC）中的应用

皮肤SCC起源于角质形成细胞，有转移倾向，接受免疫抑制剂者患皮肤SCC风险较健康人增加。使用BRAF或广谱激酶抑制剂者常易出现鳞状细胞增生活跃病变和皮肤SCC［17］。已有学者在散发皮肤SCC中检测出关键驱动突变，如TP53、NOTCH、RAS突变；在使用激酶抑制剂诱发的皮肤SCC中存在RAS突变。South等［18］对20例皮肤SCC组织行外显子组测序，并对91例新鲜冰冻皮肤SCC组织和21例皮肤SCC细胞系及39例使用BRAF抑制剂（威罗菲尼）产生皮肤SCC和鳞状细胞增生活跃病变的组织行目标区域测序验证。结果在外显子组测序筛查出2万余个非同义突变。相比其他肿瘤存在上千个基因突变，该结果提示，皮肤SCC存在更多的突变，作者证实，皮肤SCC突变数增多的一个因素是细胞周期晚期的S期复制，其中于外显子区筛查的68个高频突变基因中62%有晚期S期复制。作者在验证实验中提示，NOTCH1突变是威罗菲尼驱动的角质形成细胞克隆增生的必要条件。该研究还发现，在使用威罗菲尼的患者中，NOTCH1突变率为49%，在皮肤SCC组织中为82%，而在正常皮肤组织中为70%，表明在一定的临床环境中，皮肤SCC瘤旁正常组织中稍低的NOTCH1突变率可促发场效应。综上表明，正常皮肤有抑制肿瘤的特征，干扰组织中主要信号通路可使起初存在的肿瘤克隆群快速扩散，提示NOTCH1突变为皮肤SCC的早期事件。

KMT2C是近期发现提示侵袭性皮肤SCC预后的一个指标。2014 年，Pickering等［19］对 39 例侵袭性皮肤SCC组织行外显子组测序，检测出23个候选驱动基因，包括肿瘤相关基因TP53、CDKN2A、NOTCH1、AJUBA、HRAS、CASP8、FAT1、KMT2C（MLL3）及3个新的候选抑癌基因NOTCH2、PARD3及RASA1。其中KMT2C突变与皮肤SCC不良预后相关，可增加骨骼浸润深度。

3 在皮肤基底细胞癌（BCC）中的应用

皮肤BCC是最常见的皮肤肿瘤，生长较缓慢，临床表现和形态多样，很少发生转移。Jayaraman等［20］对皮肤BCC组织行外显子组测序，发现皮肤BCC是突变类型最多的肿瘤。

SHH信号通路重要成员包括 SHH、PTCH1、SMO、GLI。PTCH1在通路中起负调控作用。PTCH1胞外部分与SHH粘合激活GLI转录因子，从而调控SHH通路靶向基因的转录。TP53是涉及BCC发病起源的另一基因，编码p53蛋白，通过调节细胞周期、激活DNA损伤修复、诱导细胞凋亡维持基因稳定性。该研究中PTCH1和TP53的突变率分别为75%和66%。PTCH1突变主要是非同义和剪切位点的突变；TP53突变主要为错义突变。Jayaraman等［20］提出PTCH1突变在皮肤BCC发病中起核心作用。

痣样基底细胞癌综合征是一种常染色体显性遗传疾病，以皮肤基底细胞癌和多器官发育异常为主要临床特征。为探讨痣样基底细胞癌综合征患者并发基底细胞癌的发病机制，Tate等［21］用外显子组测序及Sanger测序验证检测出LATS1基因突变。LATS1突变存在于浸润性基底细胞癌，而在表浅基底细胞癌中未检测到。Hippo通路调控器官大小、保持细胞增殖凋亡平衡等。抑癌基因LATS1是Hippo通路的中介物质。该研究提出，LAST1为皮肤BCC进展的一个靶向基因，表明Hippo通路参与痣样基底细胞癌综合征患者并发皮肤BCC的进展，提出Hippo通路是治疗有侵袭性BCC的痣样基底细胞癌综合征患者的靶向目标。

4 结语

利用外显子组测序寻找皮肤肿瘤的致病基因，成为近年研究皮肤肿瘤的重要方法之一。通过该技术对皮肤肿瘤的易感基因进行筛查，为阐明皮肤肿瘤的发病机制提供了新的理论依据，在皮肤肿瘤的基因诊断和致病基因的研究及后续的功能研究中奠定了理论基础，进而为分子靶向治疗、预后评估和判断提供依据。

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Exome sequencing in skin neoplasms

Zeng Mingfeng,Kang Xiaojing.Graduate School of Xinjiang Medical University,Urumqi 830000,China

Kang Xiaojing,Email:drkangxj666@163.com

In recent years,the incidence of skin neoplasms has been increasing year by year.Environmental factors and genetic susceptibility are considered to be key pathogenic factors of skin neoplasms.Gene mutations are closely related to the occurrence and development of skin neoplasms,which have provided clues to the pathogenesis of skin neoplasms.Numerous novel mutant genes have been found in some skin neoplasms such as malignant melanoma,skin squamous cell carcinoma and skin basal cell carcinoma.As an efficient platform for screening susceptibility genes,exome sequencing has advantages of deep coverage and high accuracy,can detect pathogenic genes and novel candidate genes in skin neoplasms and other diseases,and is of great significance for early diagnosis,treatment and predilection of prognosis of skin neoplasms.

Skin neoplasms;Exome;Multilocus sequence typing;Genes;Mutation

随着肿瘤分子生物学研究的不断发展，遗传易感因素在皮肤肿瘤的发病机制中越显重要，检测易感基因已成为研究皮肤肿瘤发病机制的新方向。外显子组测序是一种利用序列捕获技术将基因组外显子区域DNA捕获并富集后进行高通量测序的基因组分析方法，为发现致病基因提供高效平台。虽然外显子区域仅占人类基因组约1%，但人类疾病约85%的基因突变与外显子区域相关［1］。外显子组测序技术具有耗时短、成本低、通量大等特点，可对传统的焦磷酸测序不能检测出的突变基因进一步筛查。在寻找皮肤肿瘤致病基因方面外显子组测序已取得显著成果，对阐明皮肤肿瘤发病机制、获得靶向治疗目标及预后评估等具有重要意义。

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2015.05.019

新疆维吾尔自治区国际科技合作计划项目（20146022）

830000乌鲁木齐，新疆医科大学（曾明凤）；新疆维吾尔自治区人民医院皮肤性病科（曾明凤、康晓静）

康晓静，Email:drkangxj666@163.com

本文主要缩写：UM：葡萄膜黑素瘤，SCC：鳞状细胞癌 ，BCC：基底细胞癌

2014-11-07）