HIV-1病毒载量检测常用技术及研究进展

张　岭，蒋　岩，潘品良

HIV-1病毒载量检测常用技术及研究进展

张岭，蒋岩，潘品良

病毒载量检测是HIV-1感染后需要长期观察的重要指标，在基础研究、早期感染的诊断、药物治疗学研究和流行病学监测方面都有特殊的意义。目前普遍使用的HIV病毒载量检测主要是测定血浆中病毒RNA的量，采用的方法包括荧光定量PCR技术、核酸等温扩增技术以及分支DNA杂交技术等。检测的样本包括血清、分泌物及全血制备的干血斑等多种类型，检测的靶点也会涉及到细胞基因组中整合的病毒DNA的应用。反转录酶法检测技术和其他等温扩增技术等许多技术已用于实验检测，一些交叉学科技术正进行着实验性探索。我国已有HIV-1病毒载量检测实验室140余家，3种经典的检测技术均有涉及。各种技术特点不同，但在病毒载量检测工作中均发挥巨大的作用。

HIV-1；病毒载量；分支DNA信号扩增试验；综述

据WHO统计，2013年全球有970万HIV感染者接受抗病毒治疗（antiretroviral therapy，ART），至2015年底预计有1500万感染者将接受ART［1］。参照美国国立卫生研究院发布的指导原则，中国制订了《艾滋病治疗手册》，规定接受治疗的感染者必须定期检测血浆中HIV-1 RNA水平（病毒载量），以反映药物疗效，预防耐药的发生。当接受ART后病毒载量＞200copies/ml时可认为治疗失败，须调整治疗方案［2］。

如上所述，目前病毒载量检测的靶点一般为RNA，检测试剂包括罗氏诊断的 Cobas AmpliPre/Cobas TaqMan HIV-1 Testv 2.0、雅培公司的RealTime HIV-1、梅里埃公司的NucliSens EasyQ HIV-1 v2.0及和西门子公司的Versant HIV-1 RNA 3.0 assay（b-DNA）。除此以外，Cavidi公司还开发了以反转录酶为靶点的病毒载量检测试剂exavir load。近年国内基于实时荧光定量技术与不同的核酸提取方法进行研制，凯杰、达安基因、东北制药、宝瑞源、珠海丽珠与万泰生物等企业研制开发了国内的HIV-1病毒载量检测试剂盒。

1　样本类型

HIV载量检测的待测样本通常为血浆。考虑到肝素是Taq酶的抑制剂，目前已上市的多个病毒载量检测试剂在使用时应避免用肝素抗凝，一般使用EDTA作为抗凝剂。另外，血清样品也可用于测试，但同一患者的血清和血浆样品同时检测时，血清的病毒载量结果会略低于血浆样品检测结果。

针对HIV的性传播特性，研究表明精液中的病毒载量与血浆病毒载量存在正相关关系，且前者略低于后者［3-4］，但也有部分感染者精液病毒载量会高于血浆，可能是受生殖道内免疫功能的影响。而受阴道内酸性环境的影响，HIV女性感染者阴道分泌物中的病毒含量值变化很大［5］。另外，唾液中也可检出HIV，但数值大大低于血浆病毒载量结果。

针对全血样品，目前应用最多的是干血斑这种处理方式。2010年3月，WHO发布了使用干血斑样本作为替代样本进行HIV耐药检测的操作手册［6］。2014年，Smit等［7］总结了以往的13项研究，提出使用干血斑进行病毒载量检测时，若检测限定为1000 copies/ml，灵敏度为78%～100%；若检测限定为5000 copies/ml，灵敏度可提升至100%。另外，因为血浆病毒载量只检测游离病毒，而干血斑检测细胞内RNA及整合入染色体的病毒前体DNA，所以还存在假阳性问题，影响对抗病毒治疗的监测［8］。

2010年开始，美国疾病预防控制中心针对HIV病毒载量检测推行一种实验室能力验证系统，它所下发的考核样品为干血管（dried tube specimens，DTS）［9］。该样品类型室温条件下可稳定8周，且没有传染性，所以对运输条件没有严格要求。另外，复溶之后，现有的病毒载量检测系统均可对该类型样本进行检测。所以DTS可替代传统的液态血浆标本完成实验室能力验证工作，但由于其制备流程复杂，还不能大规模用于常规的病毒载量检测［10］。

2　HIV-1病毒载量检测技术

HIV-1病毒载量检测方法有多种原理，常用的包括核酸等温扩增、实时定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）、分支DNA技术、非核酸的酶法检测等，另外很多交叉学科也在HIV检测方面进行了试验型探索。分别介绍如下。

2.1核酸等温扩增技术目前核酸等温扩增技术主要有4种，解旋酶依赖性扩增［11］、环介导等温扩增［12］、核酸序列依赖性扩增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）和重组酶聚合酶扩增［13］，均在HIV病毒载量检测中有不同程度的应用，其中应用最为成熟的是NASBA技术。

1991年，Cangene公司的Compton［14］在Nature上刊文，介绍了NASBA技术。该技术可以与其他很多技术结合，实现诊断的目的。Mollasalehi和Yazdanparast［15］用纳米金检测NASBA扩增产物，获得良好效果。Zhao和Dong等［16］将NASBA技术与芯片技术结合，可同时检测一个样本的多个指标。2002年，生物梅里埃公司Weusten等［17］将分子信标与NASBA技术相结合，建立了实时检测体系，并且推导出相应的病毒载量计算公式，形成NucliSENS EasyQ HIV-1病毒载量检测试剂盒。2005年，在一项有4个实验室参加的多中心评价中，该试剂盒的线性、特异性和重复性与当时已上市的病毒载量试剂盒没有明显区别，且对于非B亚型和O亚型检测效果更好［18］。

由于NASBA技术为RNA扩增，不会受基因组DNA的影响，所以在很多研究中将EasyQ试剂与干血斑采样方式相结合，用于偏远地区的抗病毒治疗监测，取得良好效果。Mercier-Delarue等［19］发现，针对干血斑样品，实时PCR方法的特异性为58/70，而NASBA技术的特异性为95/97，很明显NASBA由于可排除染色体DNA干扰特异性更高。

2.2实时荧光PCR技术1996年，Heid等［20］在Genome Research上发表文章，详细说明了TaqMan探针、实时荧光PCR以及基于此的核酸定量原理和计算公式，形成了第二代PCR技术。目前很多公司以实时荧光定量PCR为基础，开发出HIV病毒载量诊断试剂。有代表性的包括罗氏公司的Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HIV-1 test（CAP/CTM）以及雅培公司的m2000 real-time HIV assay。

罗氏公司的CAP/CTM 1.0试剂采用标准的TaqMan探针技术，随着应用越来越多，发现该试剂的亚型覆盖不够全面，另外其灵敏度较差，容易出现假阴性结果［21］。针对这些问题罗氏公司对试剂进行了改进，推出CAP/CTM 2.0，在原来gag区靶基因的基础上增加一段3'-UTR区序列作为靶基因，收到良好的效果。雅培公司的HIV-1 assay与罗氏公司产品相类似，只是其靶基因选在pol基因的整合酶片段内。另外检测下限也有所不同。

上述两套系统均采用全自动设备，利用磁珠吸附的原理完成核酸提取，所以设备成本高、尺寸大、运行时间长。而临床需要快速简便的病毒载量检测方法，针对这一需求，很多公司开发出以PCR为原理的POCT系统。例如罗氏的Cobas Liat系统以及Alere公司的Alere q HIV analyzer，都是将样本核酸提取和扩增过程集中到一块微流样本卡上，在特定仪器上完成扩增后直接读数，方便快捷。

目前，很多国内厂家也利用实时荧光PCR技术开发出HIV-1病毒载量检测试剂。已通过国家食品药品监督管理局注册认证的HIV病毒载量检测试剂有6个（表1）。

表1　国产HIV-1病毒载量检测试剂Table 1　Domestic HIV-1 viral load testing kits

2.3分支链DNA信号放大技术（branched DNA，bDNA）bDNA技术是Chiron公司开发出的检测技术，于1993年首先用于HIV检测。该技术的优点是不需要核酸提取过程，不需要反转录及PCR扩增，并且对样品要求低，溶血样品和福尔马林固定过的组织样品也可以检测。Versant HIV-1 RNA 3.0 assay是西门子公司基于bDNA原理的产品，由于该技术不依赖于核酸扩增，所以受扩增条件的影响小。体现在检测结果上，低载量的样品检测结果的重复性优于PCR方法，适用于用药患者病毒载量的监测。

2.4非核酸检测技术ExaVir Load是瑞典Cavidi公司开发的HIV-1病毒载量检测试剂盒，该试剂盒不是以核酸为检测靶点，而是以病毒的反转录酶为靶点，用特殊的底物检测样品中反转录酶的活性来折算病毒载量。由于不涉及核酸，所以该方法可覆盖各种亚型，并且也不需要复杂的仪器设备。Huang等［22］于2010年收集了87例患者的215份样品，对ExaVir Load第2版和第3版进行了评价，以罗氏Cobas TaqMan系统为参照。结果显示ExaVir Load 第3版的检出率为95.3%，检测结果与罗氏结果相关系数为0.95。

2.5探索性的研究技术在多项探索性研究中，人们将分子生物学技术、生物传感器技术及纳米技术相结合，应用于HIV病毒检测中。Sun等［23］将外切酶介导的目的片段循环技术与银离子探针相结合，通过检测游离银离子浓度实现HIV DNA的检测。Shafiee等［24］设计了一种具有纳米结构的光子晶体，在晶体上连接特异的抗体直接捕获生物样本中的完整HIV-1病毒颗粒，通过反射光波长的偏移检测HIV-1病毒载量。Yan等［25］用光子点聚合物作为示踪剂，以氧化铁微球作为捕获剂，两者均标记寡核苷酸链，与HIV DNA互补结合，以光子点的量计算病毒载量。上述方法由于还处在试验阶段，灵敏度均在105copies/ml左右，还远没有达到临床要求。

3　方法学比较

不同方法因原理不同，在检测过程中各有其特点。下面就国内常用病毒载量检测方法的灵敏度、特异性、重复性和定值进行比较。

3.1灵敏度目前国内常用的HIV-1病毒载量检测试剂的检测下限见表2。单纯从检测下限看EasyQ的灵敏度最高，bDNA的灵敏度最低，这与文献报道的略有不同。2005年，de Mendoza等［18］在对EasyQ进行试剂评价时完成了2项试验，在121例样品的试验中，Amplicor的检出率为94%，EasyQ的检出率为91%；113例样品的试验中bDNA的检出率为51%，而EasyQ的检出率为68%。2007年，Holguín等［26］收集了83例非B亚型或重组型HIV感染者的血浆，分别用bDNA、CAP/CTM和EasyQ测定病毒载量，评价3种试剂对低值样品的检测能力。结果显示接受抗病毒治疗的28例样本3种方法结果均为阴性，而其余55例原始患者bDNA、CAP/ CTM和EasyQ检测呈阴性的比例分别为20.0%、14.6%和32.7%。这2项研究中Amplicor或CAP/ CTM（反转录PCR方法）的灵敏度最高。

表2　不同试剂主要性能指标Table 2　Comparison of main performance of current HIV-1 viral load testing kits

3.2特异性各种试剂均有提高其特异性的设计，例如CAP/CTM试剂采用UNG酶-dUTP系统，可以预防环境中之前的扩增产物对本次检测的影响。bDNA试剂的预杂交探针中有一部分包含非天然核苷（isoC、isoG），该部分探针可以去除非特异性结合，提高信号/噪声比。EasyQ试剂本身就是RNA扩增方式，可以去除血浆中残留的DNA（如外泌体DNA）对扩增的干扰。

3.3重复性病毒载量检测的主要目的之一就是对接受抗病毒治疗的患者进行监测，评价药物疗效、预防耐药发生、监控患者病情发展。而这部分患者的血浆病毒载量一般都很低或小于检测限，所以评价试剂对低载量样品的检测重复性非常有意义。普遍认为bDNA方法检测结果的稳定性最好。Lubelchek等［27］比较了Amplicor和bDNA对低载量样品的检测能力，结果显示Amplicor的变异系数为0.55，而bDNA的变异系数为0.19。

3.4定值本实验室2007年利用国内样品（主要为CRF_BC型）对早期的3种方法进行了评价，结果显示同一样品COBAS Amplicor Version 1.5（RTPCR，Amplicor）检测得到的病毒载量值最高，其次为Versant HIV-1 RNA 3.0 assay（bDNA），而NucliSens HIV-1 QT（NASBA）得到的病毒载量值最低［28］。Pyne等［29］用包含9个亚型的血清盘对Cobas Ampli-Prep/Cobas TaqMan（CAP/CTM）、Amplicor以及bDNA 3种方法进行评价，结果显示CAP/CTM和Amplicor的检测结果明显高于 bDNA。另外，在上文Holguín等［26］的工作中，EasyQ的检测结果最高，平均为4.87 log10copies/ml，bDNA得到的结果最低，平均为4.16 log10copies/ml，相差0.7 log10copies/ml。可见bDNA的定值最低，推测可能的原因是bDNA体系中含有复杂的探针系统，样品和标准品之间探针杂交效率的微小差异会直接影响最终计算得到的病毒载量值。

4　总　结

病毒载量检测技术主要用于解决与HIV感染有关的理论和实际问题，包括病毒活性与病程的关系及病毒稳态与预后的关系，在临床试验中对抗病毒药物进行评价，可以在出现临床症状之前开始用药，在临床症状发展之前判断药物治疗是否失败，评价治疗方案的有效性等。

现在病毒载量检测除了与抗病毒治疗相结合以外，相关技术还可应用于不确定病例的诊断，特别是窗口期患者［免疫学检测的窗口期为（19±2）d，而核酸检测窗口期为（10±2）d［30］］以及晚期感染者（晚期患者抗原反应性衰减，检测结果会呈现不确定型）的诊断。另外在血源筛查及高危人群的筛查方面，汇集方式的病毒载量检测即可以缩短检测窗口期，提高灵敏度，如果策略得当的话还可以降低检测成本。

随着HIV病毒载量应用的普及，检测技术也有了长足的进步，但总体上有以下几个发展方向。第一，实时荧光检测技术成为主流，该技术由于成本低、操作简单、技术积累丰富等优点，在病毒载量检测中发挥越来越大的作用。目前国内厂家的病毒载量检测试剂均是基于实时PCR技术开发的，其他技术例如分支DNA技术已逐步退出载量检测领域。第二，检测设备趋向于一体化，或者是大型的全自动设备完成样本处理和检测，或者发展成小型的POCT产品，而核酸等温扩增技术由于对反应条件要求很低，最有希望开发成POCT产品。第三，由于抗病毒药物的使用，多数HIV-1感染者血浆中的病毒会得到控制，表现为经典的病毒载量检测结果小于检测下限，此时为了更好地评价治疗效果，细胞基因组中整合的HIV成为研究热点，它的水平高低决定着患者预后。目前不是所有试剂都可以检测病毒DNA，相关检测标准和检测策略还有待完善。

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（2015-10-10收稿2015-11-17修回）

（责任编委曲芬本文编辑卢福昱）

Current techniques and research progress of HIV-1 viral load testing

ZHANG Ling，JIANG Yan，PAN Pin-liang*National Center for AIDS/STD Control and Prevention，China Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China *Corresponding author，E-mail:panpinliang@chinaaids.cn

Viral load testing is a pivotal measurement of HIV-1 infections，and is meaningful in fundamental research，diagnosis of acute infection，therapeutic research as well as epidemiological monitoring.Classical HIV viral load testing refers to the measurement of viral RNA by techniques such as real-time PCR，isothermal amplification of nucleic acid，or branched DNA hybrization.Sample candidates cover serum，discharge and dried whole blood spots，and consequently，the testing target expands to pro-viral DNA integrated in the host genome.In addition，more and more techniques，including reverse transcriptase assay and new isothermal amplification，are applied in the testing，and interdisciplinary attempts are still under way.Presently，HIV-1 viral load testing is carried out in more than 140 laboratories in China，among which three cardinal techniques are applied.In spite of the different nature of the techniques，they all play an important role in HIV viral load testing.

HIV-1；viral load；branched DNA signal amplification assay；review

潘品良，E-mail:panpinliang@chinaaids.cn

10.3969/j.issn.1007-8134.2015.06.005

国家“十二五”科技重大专项（2012ZX10001001-001-002）

102206北京，中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心（张岭、蒋岩、潘品良）