细胞治疗与AIDS功能性治愈

史继静，张　昕，徐若男，王福生

·论著·

细胞治疗与AIDS功能性治愈

史继静，张昕，徐若男，王福生

HIV可与被感染细胞的基因组整合形成潜伏感染，进而构成机体的病毒储存库，后者是联合抗反转录病毒疗法无法彻底清除病毒、治愈AIDS的根源，探索有效的策略来实现AIDS的功能性治愈是目前AIDS研究的热点。“柏林病人”重新定义了HIV感染治疗的结局，燃起了人类治愈AIDS的希望和信心。目前，以干细胞、T细胞等为主的细胞治疗策略被认为是治愈HIV感染的主要策略之一。本文就近年来细胞治疗在AIDS功能性治愈中的研究进行概述。

获得性免疫缺陷综合征；HIV；治疗结果

自1981年首次从美国同性恋患者体内发现HIV以来，据WHO统计，截至2014年全世界HIV感染者已超过3500万［1］，严重威胁人类身体健康。联合抗反转录病毒疗法（combination antiretroviral therapy，cART）的问世带来AIDS治疗史上的革命性进展，但由于患者体内病毒储存库持续存在，导致cART无法彻底治愈HIV感染，寻求有效策略彻底清除病毒成为亟待解决的问题。“柏林病人”的出现给人类攻克AIDS燃起希望和曙光［2-3］，免疫策略尤其是以干细胞为主的细胞疗法成为研究热点和重点之一。本文就HIV潜伏持续存在的机制及细胞治疗在实现AIDS功能性治愈中的作用讨论如下。

1　HIV储存库与功能性治愈

1.1HIV潜伏感染的形成HIV与宿主基因组整合后可中止转录、翻译等生命过程，与靶细胞共同维持静息状态形成潜伏感染，进而在机体内构成稳定的前病毒储存库，成为AIDS无法彻底治愈的根源，一旦宿主细胞被活化或cART中断即可产生具有感染力的病毒，导致停药后几乎全部复发。早在1995年，首次证实HIV感染者体内存在潜伏感染形成的HIV储存库，进一步分析发现其在急性感染早期大概感染后几天内即可形成，在接受cART的患者体内亦可持续存在［4-5］，随后其特点及形成机制被逐步揭示。

Chomont等［6］发现大部分的病毒储存库存在于中枢记忆性和过渡记忆性CD4+T淋巴细胞，且二者相对比例与患者体内CD4+T淋巴细胞计数有关。记忆性CD4+T淋巴细胞较长的半衰期决定了HIV储存库的长期存在，理论上需要73年才能彻底清除［4］。随后发现纯真CD4+T淋巴细胞、Tfh细胞、巨噬细胞、造血干细胞、树突状细胞、胸腺细胞、星形胶质细胞等亦是HIV潜伏感染的靶细胞［6-8］。同时，在中枢神经系统、肠道相关淋巴组织等药物赦免位置或药物代谢尚不明确部位亦潜存病毒。新近发现B细胞滤泡可作为猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，SIV）的庇护所，允许SIV感染猴子精英控制者体内病毒持续产生［9］。

对HIV潜伏感染形成机制进行研究发现，其在分子水平上主要受病毒cDNA整合位点、宿主细胞转录因子的可用性、病毒基因表达的表观遗传调控以及HIV-1转录状态对细胞核拓扑结构的依赖等因素影响［10］。同时，从免疫学机制上分析，机体HIV特异性免疫无法识别和清除被感染细胞亦是导致HIV潜伏库持续存在的重要因素［8］。

1.2AIDS功能性治愈目前，AIDS的治愈标准分为彻底治愈和功能性治愈。前者指从体内彻底清除病毒；后者与前者不同，体内病毒并未完全清除，但在停用cART后，体内病毒仍控制在检测限以下，且CD4+T淋巴细胞的数量和功能维持正常，临床无免疫缺陷和疾病进展的表现。由于HIV储存库的存在以及病毒的高变异性，实现AIDS彻底治愈困难重重，功能性治愈被认为是最有可能达到的目标［11］。

继2011年Dieffenbach和Fauci［12］提出HIV功能性治愈的概念后，Lampton［13］在2013年首次报道1例功能性治愈婴儿，即“密西西比婴儿”。不幸的是，2014年7月，美国专家宣布时隔12个月后在该患儿体内再次检测出病毒，说明病毒库在体内伴随感染之时便已建立。该患儿的治疗虽然最终未能达到功能性治愈，但仍为婴幼儿患者可能通过早期高效抗反转录病毒疗法（highly active antiretroviral therapy，HAART）控制病毒的进一步复制及病毒储存库的建立，而达到AIDS功能性治愈提供了思路。

除著名的“柏林病人”外，目前在二类患者身上实现了功能性治愈。一类是仅占HIV感染者1%的精英控制者，此类患者体内依然存在具有复制能力的病毒和较低水平的病毒潜伏库，但在不进行HAART的情况下，机体可自发有效地控制病毒至检测限以下。对其机制进行分析发现，与此类患者具有保护性的人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）等位基因如HILA-B*27、B*57和B*5801有关，这些等位基因被认为可呈递保守的免疫显性表位，激发较强的HIV特异性CD8+T淋巴细胞反应，从而有效控制体内潜伏病毒［14］。另一类是急性感染早期即开始HAART的患者，此类患者不具备精英控制者的HLA保护性等位基因，体内亦缺乏较强的HIV特异性细胞毒性T淋巴细胞应答，但在中断治疗数年后病毒仍可较好地被控制在检测限以下。进一步随访分析发现，与大多数慢性感染阶段才开始抗病毒治疗的患者相比，此类患者中断治疗后体内长期存活的静息CD4+T淋巴细胞在总的病毒储存库中仅占较小比例，表明早期抗病毒治疗可显著降低长期存活记忆细胞中病毒储存库的形成［15］。同时，亦有学者报道HAART在感染早期启动后，一旦中断，多数患者将出现病毒反弹［16］。因此，须进一步优化抗HIV感染的治疗方案，寻找最佳的治疗时机和策略来实现AIDS功能性治愈。

2　细胞治疗在实现AIDS功能性治愈中的探索

实现AIDS功能性治愈不仅须要抑制血浆病毒复制，同时须要最大限度地减少病毒库，并控制潜伏或残留病毒的复制，避免停药后复发。目前的HAART药物虽然能使患者血浆中的病毒载量大幅度下降，甚至达到检测不出的水平，但是药物对潜伏的病毒，尤其是潜伏在静止淋巴细胞内的病毒无能为力，不能从宿主细胞中移走病毒的遗传物质；一旦停药，潜伏病毒会在体内重新繁殖，导致疾病再燃，因而无法彻底治愈［17］。

近年来，随着AIDS功能性治愈研究的增多和深入，出现很多有前景的方法，部分已进入临床试验阶段。因罹患白血病接受2次造血干细胞移植（植入的干细胞携带对HIV入侵具有抵抗力的CCR5突变的纯合子基因——CCR5Δ32/Δ32）而实现AIDS治愈的“柏林病人”的出现，使细胞治疗在控制病毒复制中的作用受到密切关注，并开展了广泛探索。

2.1未进行基因修饰的免疫细胞治疗著名的“波士顿病人”因发生恶性淋巴瘤而进行造血干细胞移植，与“柏林病人”不同，植入的干细胞是CCR5野生型，对HIV入侵不具有抵抗力，移植后停止HAART曾一度检测不到病毒，提示造血干细胞移植过程中发生的嵌合效应或移植物抗宿主反应在HIV清除中起重要作用，但数月后病毒反弹而不得不继续抗病毒治疗。这2例“波士顿病人”未实现功能性治愈，但像“柏林病人”一样，鼓舞了科学家利用干细胞手段治愈HIV感染的信心［18］。随后，另有2例并发恶性肿瘤的HIV感染者植入携带CCR5Δ32/Δ32的成人干细胞，但于4个月后因感染而死亡［19］。

“柏林病人”治愈的关键在于植入了携带对HIV感染具有抵抗力的纯合子基因CCR5Δ32/Δ32的供体造血干细胞，但是携带该类基因的个体很少，在北欧人群中仅占0.8%～1.0%，其他种族更少［1］。同时造血干细胞移植需要严格的HLA配型，大部分HIV感染者不可能重现“柏林病人”的成功，因此有学者报道采用CCR5Δ32/Δ32的脐血干细胞移植治疗HIV感染，并有望成为目前治疗HIV感染最可行的方法［20］。Duarte等［21］采用CCR5Δ32/Δ32脐血干细胞移植治疗1例并发B细胞淋巴瘤的HIV感染者，先后进行2次移植。第1次移植后第7周嵌合率＜5%，第52天又进行第2次移植并取得成功，第73天检测嵌合率为100%，至此患者的造血细胞包括T淋巴细胞均转变为CCR5Δ32/Δ32突变型。对其血浆病毒载量检测发现移植后快速下降，到完全嵌合时达到最低，且检测不到HIV DNA。遗憾的是，移植后3个月患者因淋巴瘤病情恶化而死亡。

除造血干细胞和脐血干细胞外，脐带间充质干细胞亦被用于HIV感染的治疗。王福生团队用人脐带间充质干细胞治疗经HAART免疫重建失败的HIV感染者，发现该方法可显著增加患者CD4+T淋巴细胞数量，降低免疫系统超活化，为用于细胞治疗的细胞种类的选择提供了一种参考［22］。

2.2基因修饰的免疫细胞治疗鉴于CCR5Δ32/ Δ32突变体的稀缺，通过基因改造技术制造CCR5表达缺陷的免疫细胞（通常为干细胞和T细胞），从而使HIV无法侵入免疫系统，重现“柏林病人”的成功，成为AIDS功能性治愈研究的热点。自20世纪90年代晚期开始，已有不少科学家进行基因修饰细胞用于HIV感染治疗安全性、可行性和有效性的探索。抗HIV的核酸酶、反义转录、RNA诱饵等技术被广泛应用。

Tebas等［23］在体外运用锌指核酸酶技术敲除患者CD4+T淋巴细胞的CCR5基因，扩增培养后回输患者体内，经Ⅰ期临床试验证实是安全可行的。在经Ⅰ期临床试验证实转导OZI（一种反转录载体，携带抗病毒RNA编码蛋白Tat和Vpr的核酸酶基因）的T细胞和CD34+造血干细胞回输疗法安全和有效的基础上，美国加州大学洛杉矶分校完成了第1个随机、双盲、安慰剂对照的干细胞基因疗法Ⅱ期临床试验，共入组74例患者。动员患者的CD34+造血前体细胞（hematopoietic progenitor and stem cells，HPSCs）转导OZI后重新输入患者体内。回输后47～48周2组患者血浆病毒载量无明显差异，40～100周治疗组病毒载量明显下降，且至100周时体内CD4+T淋巴细胞数量较对照组显著增加。这一研究首次证实了经基因修饰的HPSCs输入患者体内的安全性和有效性［24］。Wolstein等［25］利用慢病毒载体LVsh5/c46（同时编码下调CCR5表达的发夹RNA 和HIV融合抑制剂c46）转导CD34+HPSCs和T细胞，进行了临床前安全性和有效性实验，目前正在进行Ⅰ/Ⅱ期临床试验（NCT01734850），同时这也是第1个用RNAi联合C46抑制剂进行免疫细胞基因修饰治疗HIV感染的临床试验。

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T）是当前过继性细胞治疗技术中的最新技术之一，实现了从基础免疫学机制研究到临床免疫治疗应用的转变。早在20年前科学家们已尝试将CAR-T用于HIV感染治疗中，Scholler等［26］对1998—2005年3项临床试验（Mitsuyasu、Deeks和Aronson试验）的患者随访发现，表达CD4ζ CAR的自体CD4+和CD8+T淋巴细胞在HIV感染者体内可稳定存活至少11年，显示出CAR-T在HIV感染细胞治疗领域的强大潜力。HIV Env特异性地表达CD4-CD3ζ嵌合受体的T细胞在体外试验中可有效杀死HIV感染细胞或表达HIV Env蛋白的细胞，但这种第1代CAR-T在随后的Ⅰ期和Ⅱ期临床试验中并未获得成功。Sahu等［27］设计出的第2代CAR-T（命名为CD4-CD28-CD3ζ）不仅可杀死表达HIV Env蛋白的细胞，且在细胞系模型上证实可以激活潜存的HIV并将其清除，为寻求有效策略实现AIDS功能性治愈甚至彻底治愈提供了参考。造血干细胞具有分化为多种免疫细胞的能力，因此与CD4+T淋巴细胞相比，基因修饰的造血干细胞可以长期提供抵抗病毒感染的免疫细胞亚群，几乎涵盖了已知的所有能被HIV感染的靶细胞［28］。但现有的临床试验证实2种细胞均未获得理想疗效，体外靶基因较低的转导效率和转导导致较多异源基因进入靶细胞，以及植入后可检测到的修饰细胞含量极低等可能是限制其疗效的重要因素。因此，如何克服上述障碍，延长修饰细胞在体内的存活时间和提高植入率是提高疗效的关键。Ye等［29］采用TALENs或RNA引导的CRISPR-Cas9核酸酶技术与piggyBac技术联合，设计出携带无残存序列的CCR5Δ32突变体的多能干细胞，转导效率优于目前常用的干细胞基因改造技术，并在体外将其诱导分化为抗HIV感染的单核细胞和巨噬细胞。

Myburgh等［30］利用RNAi技术，将敲除CCR5的慢病毒载体转导HPSCs后植入人源化小鼠模型，移植后小鼠对CCR5-HIV病毒株有持久抵抗力，且数月后病毒载量明显降低，人源化CD4+T淋巴细胞持续存在。表明这种基于HPSCs的CCR5敲除策略有望在体内有效控制HIV，且人源化CD4+T淋巴细胞的持续存在克服了以往只有较少比例抗HIV细胞存在的局限性，有望持久提供抗HIV的免疫活性细胞。

病毒基因偏嗜性的改变对细胞治疗疗效亦有较大影响。Kordelas等［31］报道1例体内可检测出CXCR4-HIV RNA的患者进行了CCR5Δ32/Δ32突变型造血干细胞移植，在清髓治疗开始时停用抗病毒药物，但移植后3周因病毒反弹而继续cART，移植后12个月因非霍奇金淋巴瘤而死亡。对其基因型进行分析发现移植前以CCR5-HIV为主，移植后转变为以CXCR4为主，但并不清楚这种共受体转变在抗病毒治疗前后何时发生。这个病例的出现预示病毒偏嗜性变异可能成为利用CCR5敲除策略控制HIV感染的重要影响因素，因此AIDS的治愈需要多途径、多策略的有效联合。

3　小结与展望

过去30多年，人类对抗AIDS的战役经历了3次革命性进展。1996年cART的问世，无疑是第1次革命，具有划时代意义，几乎从根本上改变了AIDS的疾病进展，使其由致死性疾病转为某种程度上可控的慢性疾病。cART在高效抑制患者体内病毒复制的同时，依然存在无法彻底恢复机体免疫功能、停药后病毒快速反弹、耐药菌株出现、长期服药伴随的依从性较低、经济负担过重、精神压力较大等问题。这迫使人们不得不对其进行深入研究，以寻求更佳的治疗方法。长期存活的病毒储存库的发现成为HIV感染研究里程上的第2次革命性进展，很好解释了cART无法彻底治愈HIV感染的原因，对今后寻求有效策略清除病毒具有重要意义。2009年“柏林病人”的出现给人类实现AIDS治愈带来希望和曙光，迎来抗AIDS战役的第3次革命。目前，针对HIV储存库的清除策略主要有早期治疗、抗病毒药物的强化治疗、基因治疗和免疫治疗等。以干细胞基因修饰为主的细胞治疗虽然未取得理想效果，但为人类攻克AIDS治愈难关提供了策略和参考。相信在不久的将来，细胞治疗手段与其他策略的联合应用能够使更多的HIV感染者实现功能性治愈，从而在HIV感染彻底治愈的道路上实现质的突破。

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（2015-10-11收稿2015-11-14修回）

（责任编委李军本文编辑王姝）

Cell therapy and functional cure for AIDS

SHI Ji-jing，ZHANG Xin，XU Ruo-nan，WANG Fu-sheng*Infectious Diseases Diagnosis，Treatment and Research Center，302 Military Hospital of China-Peking University Teaching Hospital，Beijing 100039，China *Corresponding author，E-mail:fswang302@163.com

HIV can integrate into the genomes of infected cells and persist in a stable latent reservoir.Viral reservoir is the obstacle to the eradication of HIV and a cure for AIDS in patients receiving combination antiretroviral therapy，so pursuing effective strategies for functional cure for AIDS is the focus of AIDS research.New treatment outcome of HIV infection--the eradication of HIV occurred in the"Berlin patient"，which brought hope and inspired the confidence to cure AIDS.Nowadays，cell therapy based on stem cells and T cells is regarded as one of the potential strategies to cure HIV infection.This article focuses on the recent findings on cell therapy in functional cure for AIDS.

acquired immunodeficiency syndrome；HIV；treatment outcome

王福生，E-mail:fswang302@163.com

10.3969/j.issn.1007-8134.2015.06.003

100039，北京大学解放军第三〇二医院教学医院感染性疾病诊疗与研究中心（史继静、王福生）；100039，解放军第三〇二医院感染性疾病诊疗与研究中心（张昕、徐若男、王福生）