有效的高效抗反转录病毒治疗后低CD4/CD8比值HIV/AIDS患者免疫学特征分析

张　钰，田云飞，肖　江，韩　宁，杨　涤，刘　维，赵红心

有效的高效抗反转录病毒治疗后低CD4/CD8比值HIV/AIDS患者免疫学特征分析

张钰，田云飞，肖江，韩宁，杨涤，刘维，赵红心

目的对比研究有效的高效抗反转录病毒治疗（highly active antiretroviral therapy，HAART）后低CD4/CD8比值组与高CD4/CD8比值组患者相关免疫学特征。方法选择接受HAART≥96周、CD4+T淋巴细胞≥500/μl、HIV载量低于检测值下限的HIV感染者/AIDS患者（HIV/AIDS患者）109例，从中选出CD4/CD8比值≥0.82的患者28例及CD4/CD8比值≤0.48的患者28例，对比分析2组T淋巴细胞上CD38、人类白细胞抗原DR（HLA-DR）、CD27、CD28、CD45RA及CD31的表达，进而分析2组外周血T淋巴细胞的免疫活化与免疫老化状况。结果①低CD4/CD8比值组的基线CD4+T淋巴细胞计数和基线CD4/CD8比值较高CD4/CD8比值组低（P＜0.05）；②低CD4/CD8比值组HLA-DR+CD8+T淋巴细胞频率、处于中期分化阶段（CD27-CD28+）的CD4+T淋巴细胞频率及处于晚期分化阶段（CD27-CD28-）的CD4+和CD8+T淋巴细胞频率高于高CD4/ CD8比值组（P均＜0.05），而处于早期分化阶段（CD27+CD28+）的CD4+和CD8+T淋巴细胞频率低于高CD4/CD8比值组（P均＜0.05）；③低CD4/CD8比值组纯真CD4+和与CD8+T淋巴细胞频率以及CD31+纯真CD8+T淋巴细胞的频率低于高CD4/CD8比值组（P均＜0.05）。结论①低基线CD4+T淋巴细胞计数和低基线CD4/CD8比值HIV/AIDS患者有效HAART后CD4/CD8比值仍然相对较低，应及早起始HAART，预防CD4/CD8低比值持续的发生；②有效HAART后低CD4/CD8比值的HIV/AIDS患者表现出更为严重的免疫活化和免疫老化现象，针对这些免疫紊乱应给予除HAART外新的干预措施。

获得性免疫缺陷综合征；HIV；淋巴细胞计数；T-淋巴细胞亚群

然而，有一部分HIV/AIDS患者经过长期HAART后虽然获得了相对正常的CD4+T淋巴细胞计数（≥500/μl），但其CD4/CD8比值仍处于较低水平。这部分人群的免疫学机制和临床特点尚未完全阐明。既往有报道认为，CD4/CD8比值能够预测HIV感染者进展至AIDS的时间［2］，低CD4/CD8比值患者存在一系列的免疫紊乱且与非AIDS相关性疾病发病率和病死率相关［3-8］。重要的是，较早起始HAART的患者可能比较晚起始HAART的患者CD4/CD8比值恢复更快［9-11］，而较高的CD4/CD8比值反映患者处于更加正常的免疫状态，免疫细胞更能发挥正常的免疫作用［12］。与发达国家相比，我国HIV/AIDS患者确诊时间及起始治疗时间相对较晚，因此存在一定数量的CD4/CD8比值未能恢复的人群。国内对HIV/AIDS患者接受长期HAART 后CD4+T淋巴细胞计数恢复但CD4/CD8比值较低的人群尚缺乏系统的临床及实验室报道。目前国际上对于正常的CD4/CD8比值区间尚无统一的共识，既往有大规模临床研究选取了研究人群CD4/ CD8比值的第一四分位数（Q1）和第三四分位数（Q3）（Q1=0.4，Q3=1）作为低CD4/CD8比值与高CD4/ CD8比值的界定值［13］。本研究从北京地坛医院长期随访的HIV/AIDS患者中随机收集了109例长期HAART（HAART治疗≥96周）后HIV载量达到检测不到水平且CD4+T淋巴细胞≥500/μl的患者作为研究对象，亦选用Q1（0.48）和Q3（0.82）作为界定值，对CD4/CD8比值≤0.48（28例）与CD4/CD8比值≥0.82（28例）的2组患者进行了免疫学特征的比较。现报道如下。

1　对象与方法

1.1对象

1.1.1纳入标准研究对象的纳入标准为：①HIV/ AIDS患者，年龄18周岁以上，均经免疫印迹试验确诊抗HIV阳性；②在北京地坛医院进行HAART 满96周；③进行HAART满96周时，达到了病毒学抑制［（病毒载量低于检测值下限（20 copies/ml）］；④采集标本时，CD4+T淋巴细胞≥500/μl；⑤采集标本时，患者无各种急性感染。

1.1.2对象选择于2013年8月—2014年1月观察就诊于北京地坛医院并满足上述纳入标准的HIV/AIDS患者109例，这些患者的CD4/CD8比值四分位数［Q2（Q1，Q3）］为 0.62（0.48，0.82），根据CD4/CD8比值从中选取2组患者入组：CD4/CD8≥0.82（Q3）的28例为高CD4/CD8比值组，CD4/CD8≤0.48（Q1）的28例为低CD4/CD8比值组。56例中，男42例，女14例，中位年龄为37岁，最小31岁，最大43岁；15例经异性途径性传播，31例经同性途径性传播，1例经单采血浆途径传播，1例经静脉吸毒传播，8例传播途径不明；接受HAART前（基线）CD4+T淋巴细胞计数四分位数为185（93，263）/μl；接受HAART的中位时间为220周，最短160周，最长307周。本研究经本院伦理委员会批准和监督，所有患者均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1研究方法采集2组患者的血液标本，进行免疫学表型对比分析。

1.2.2细胞检测

1.2.2.1标本采集采集患者外周静脉血10 ml，乙二胺四乙酸 （ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，常温保存。4 h内用于CD4+T淋巴细胞计数和表型分析。

1.2.2.2CD4+T淋巴细胞计数检测利用绝对计数管（Trucount，美国BD公司）及流式细胞仪（FACS Calibur，美国BD公司）检测，并用MultiSET软件分析。

1.2.2.3表型分析利用 CD4/CD8/CD27/CD28、CD4/CD8/CD38/HLA-DR及CD4/CD8/CD45RA/CD31特异性单克隆抗体组合（美国BD公司）对裂解红细胞后的全血进行表面染色，并用美国FACS Calibur流式细胞仪上机检测。

1.3统计学处理用SPSS 16.0软件对收集的数据进行统计学处理。计量资料用［Q2（Q1，Q3）］表示，2组间比较用两独立样本Wilcoxon秩和检验。计数资料用频数、频率或构成比进行描述，采用四格表χ2检验或校正χ2检验或确切概率检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结　果

2.12组患者基本情况采集标本时，低CD4/CD8比值组CD8+T淋巴细胞计数高于高CD4/CD8比值组（P＜0.05），但2组年龄、HAART周数及CD4+T淋巴细胞计数差异无统计学意义。基线时，低CD4/ CD8比值组CD4+T淋巴细胞计数及CD4/CD8比值均低于高CD4/CD8比值组（P均＜0.05），而CD8+T淋巴细胞计数差异无统计学意义。低CD4/CD8比值组男性比例高于高CD4/CD8比值组。见表1。

2.22组CD8+T淋巴细胞活化水平低CD4/CD8比值组HLA-DR+CD8+T淋巴细胞频率高于高CD4/CD8比值组（P＜0.05）。2组间CD38+CD8+T淋巴细胞和CD38+HLA-DR+CD8+T淋巴细胞频率差异无统计学意义。见表2。

表1　2组基本情况Table 1　General data of the two groups

2.32组CD4+和CD8+T淋巴细胞免疫老化程度

2.3.1CD27和CD28的表达利用CD27和CD28的表达将CD4+和CD8+T淋巴细胞分为3个亚群：早期分化亚群（CD27+CD28+）、中期分化亚群（CD27-CD28+/CD27+CD28-）及晚期分化亚群（CD27-CD28-）。

低CD4/CD8比值组处于早期分化阶段的CD4+和CD8+T淋巴细胞频率均低于高CD4/CD8比值组，而处于晚期分化阶段的CD4+和CD8+T淋巴细胞频率均高于高CD4/CD8比值组（P均＜0.05）。另外，低CD4/CD8比值组处于中期分化阶段的CD4+T淋巴细胞频率高于高CD4/CD8比值组（P＜0.05）。见表3～4。

2.3.2CD45RA和CD31的表达利用CD45RA标记CD4+和CD8+T淋巴细胞CD45RA+的纯真细胞亚群，利用CD31标记CD4+和CD8+T淋巴细胞CD31+的胸腺输出细胞。

表2　2组CD8+T淋巴细胞表达CD38和HLA-DR的频率［%，Q2（Q1，Q3）］Table 2　Expression frequency of CD38 and HLA-DR in CD8+T lymphocytes in the two groups［%，Q2（Q1，Q3）］

表3　2组CD4+T淋巴细胞表达CD27和CD28的频率［%，Q2（Q1，Q3）］Table 3　Expression frequency of CD27 and CD28 in CD4+T lymphocytes in the two groups［%，Q2（Q1，Q3）］

表4　2组CD8+T淋巴细胞表达CD27和CD28的频率［%，Q2（Q1，Q3）］Table 4　Expression frequency of CD27 and CD28 in CD8+T lymphocytes in the two groups［%，Q2（Q1，Q3）］

低CD4/CD8比值组CD4+和CD8+T淋巴细胞CD45RA表达频率低于高CD4/CD8比值组（P均＜0.05），CD45RA+CD8+T淋巴细胞CD31表达频率低于高CD4/CD8比值组（P＜0.05）。见表5～6。

表5　2组CD4+和CD8+T淋巴细胞表达CD45RA的频率［%，Q2（Q1，Q3）］Table 5　Expression frequency of CD45RA in CD4+and CD8+T lymphocytes in the two groups［%，Q2（Q1，Q3）］

表6　2组CD45RA+CD4+和CD45RA+CD8+T淋巴细胞表达CD31的频率［%，Q2（Q1，Q3）］Table 6　Expression frequency of CD31 in CD45RA+CD4+and CD45RA+CD8+T lymphocytes in the two groups［%，Q2（Q1，Q3）］

3　讨　论

长期以来，HIV/AIDS患者接受HAART后的免疫重建程度主要通过CD4+T淋巴细胞计数的恢复来评价，尽管通过有效的HAART恢复了正常的CD4+T淋巴细胞计数，但仍不能称得上恢复健康［14-16］。多项大规模临床研究发现，大部分HIV/AIDS患者在有效HAART后不能获得正常的CD4/CD8比值（不同研究采用的正常值不同，多数研究认为CD4/CD8比值＞1.0或1.2为恢复正常）［9-10］。而鉴于低CD4/CD8比值与疾病进展、免疫状态及非AIDS相关疾病的发病率及病死率之间存在的相关性［2，5-7］，以及有效HAART后低CD4/CD8比值人群的广泛存在这一现状［10］，对这一人群的相关临床及免疫学特征的研究显得尤为重要。

基线CD4+T淋巴细胞计数与有效HAART 后CD4/CD8比值恢复的相关性已经得到了广泛证实［9-11］。本研究也进一步证实了这一观点：低CD4/CD8比值组的基线CD4+T淋巴细胞计数和基线CD4/ CD8比值均显著低于高CD4/CD8比值组。说明基线CD4+T淋巴细胞计数低的患者即使治疗应答理想，但无法恢复较正常的CD4/CD8比值，仍然存在免疫恢复不理想的问题。国外一项长期研究发现，早起始HAART（感染6个月内）的患者CD4/CD8比值高于晚起始HAART（感染2年以上）的患者［12-13］，早期起始HAART可能对CD4/CD8比值快速恢复有作用，CD4/CD8比值可能能够辅助早期甄别有效HAART后疾病进展的风险［12］。

低CD4/CD8比值患者体内存在诸多免疫紊乱现象。多项研究证实，低CD4/CD8比值人群存在高水平的免疫活化和免疫老化现象［3-4］，CD4/CD8比值＜1（亦有研究定义为0.8）是免疫活化和免疫老化的一个标志［7-8］。T淋巴细胞的活化一般用CD38 和HLA-DR的表达水平表示，尤其CD8+T淋巴细胞的活化水平可用来监测疾病进展情况。已有研究证明，HAART可有效抑制外周血中HIV复制，因此AIDS患者出现的非AIDS相关疾病如恶性肿瘤及心血管疾病更多地与持续的免疫活化及低水平炎症状态有关［16］。同时，在进行HAART过程中，免疫活化的持续存在也是HIV感染过程中加速免疫老化的重要原因［17］。既往大量报道都证实了HAART后低CD4/CD8比值患者存在T淋巴细胞高活化［3，5，13］。本研究通过CD8+T淋巴细胞上CD38和HLA-DR这两个评价HIV/AIDS患者体内免疫活化状态的标志，检测了患者的T淋巴细胞活化水平，亦观察到低CD4/CD8比值组的CD8+T淋巴细胞的高水平活化（HLA-DR+CD8+T淋巴细胞频率较高）。

另一方面，T淋巴细胞免疫老化通常可以用功能亚群降低（CD28共刺激受体的丢失）及纯真T淋巴细胞亚群的降低来表示［18］。CD28分子与表达在B细胞和抗原递呈细胞表面的B7分子结合，产生协调刺激信号，诱导T淋巴细胞活化。而CD27分子与其配体CD70可以作为第二信号促进T淋巴细胞增殖，参与T淋巴细胞的分化过程。因此，T淋巴细胞上CD27和CD28分子的表达可反映T淋巴细胞功能亚群免疫活化的水平，反映T淋巴细胞能否被活化并发挥功能。而缺乏活化信号的T淋巴细胞可认为存在免疫老化现象。既往已有研究证实了有效HAART后低CD4/CD8比值组淋巴细胞功能亚群频率较低（CD28共刺激受体丢失现象严重）［13］。既往多采用CD28的表达水平判断T淋巴细胞免疫老化的程度，而目前有大量研究根据T淋巴细胞表面CD27与CD28共刺激受体的协同表达，提出了T淋巴细胞的线性分化模式，将CD4+与CD8+T淋巴细胞划分为早期分化（CD27+CD28+）、中期分化（CD27-CD28+/CD27+CD28-）与晚期分化（CD27-CD28-）亚群。本研究即采用了这一模式并观察到低CD4/CD8比值组的CD4+T淋巴细胞处于早期分化阶段的频率较低，而处于中、晚期分化阶段的频率较高；CD8+T淋巴细胞处于早期分化阶段的频率较低，而处于晚期分化阶段的频率较高。说明大量丢失了共刺激受体的T淋巴细胞在受到刺激后不能进入到细胞周期发挥作用，成为非功能亚群。这进一步验证了有效HAART后低CD4/CD8比值人群的免疫老化现象。另外，纯真T淋巴细胞亚群的频率也常常被用来衡量T淋巴细胞免疫老化的程度。本研究观察到有效HAART后低CD4/CD8比值组CD4+T淋巴细胞与CD8+T淋巴细胞纯真亚群频率较低，这也是免疫老化现象的有力佐证。值得注意的是，我们发现低CD4/CD8比值组存在较低频率的CD31+的纯真CD8+T淋巴细胞亚群。CD31是胸腺输出的标志，CD31+的纯真淋巴细胞在外周增殖后会发生CD31的丢失，其表达水平可用来监测T淋巴细胞胸腺输出的水平。低频率的CD31+的纯真CD8+T淋巴细胞亚群反映了低CD4/CD8比值组的CD8+T淋巴细胞纯真亚群的胸腺输出水平较低，较多的淋巴细胞发生了外周的增殖，推测这可能与HIV持续低水平复制等因素造成的持续免疫活化有关［19］。

综上所述，有效HAART后低CD4/CD8比值与基线低CD4+T淋巴细胞计数和基线低CD4/CD8比值有关，这部分人群的T淋巴细胞存在明显的免疫活化和免疫老化现象。鉴于低CD4/CD8比值与异常免疫状态和疾病进展的相关性，临床工作者应对这部分CD4+T淋巴细胞恢复正常但CD4/CD8比值仍然较低的患者给予充分重视，CD4/CD8比值应该成为CD4+T淋巴细胞计数之外另一个监测HIV/ AIDS患者对HAART反应的重要指标。也就是说，HIV/AIDS患者对HAART成功的应答应该既包括外周CD4+T淋巴细胞计数的恢复，又包括CD4/ CD8比值的恢复。鉴于有效HAART后低CD4/CD8比值人群的广泛存在，推测HAART可能对恢复CD4/CD8比值有局限性。今后的研究应该从机制入手，针对这部分人群，关注一些新的干预措施，如抑制免疫活化的免疫抑制剂类药物、促进胸腺输出的激素乃至祖国的中医中药等的使用。

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（2015-09-21收稿2015-10-25修回）

（责任编委王永怡本文编辑张云辉）

Immunological characteristics of HIV/AIDS patients with low CD4/CD8 ratio after receiving highly active antiretroviral therapy effectively

ZHANG Yu，TIAN Yun-fei，XIAO Jiang，HAN Ning，YANG Di，LIU Wei，ZHAO Hong-xin*Department One of Infectious Diseases，Peking University Ditan Teaching Hospital，Beijing 100015，China *Corresponding author，E-mail:13911022130@163.com

ObjectiveTo compare immunological characteristics between HIV/AIDS patients with low CD4/CD8 ratio after receiving highly active antiretroviral therapy（HAART）effectively and those with high CD4/CD8 ratio.MethodsAmong 109 HIV/AIDS patients with CD4+T lymphocyte count≥500/μl and undetectable viral load after more than 96 weeks of HAART，28 patients with CD4/CD8 ratio≥0.82 were selected as high CD4/CD8 ratio group，and 28 with CD4/CD8 ratio≤0.48 as low CD4/CD8 ratio group.The expressions of CD38，HLA-DR，CD27，CD28，CD45RA and CD31 on T lymphocytes of peripheral blood were compared between the two groups，and the immune activation and immunosenescence of the two groups were analyzed.ResultsLow CD4/CD8 ratio group showed significantly lower baseline CD4+T lymphocyte count and baseline CD4/CD8 ratio than high CD4/CD8 ratio group（P＜0.05）.Low CD4/CD8 ratio group showed significantly higher frequency of HLA-DR+cells of CD8+T lymphocytes，higher frequency of CD4+T lymphocytes in intermediate stage（CD27-CD28+），higher frequency of CD4+or CD8+T lymphocytes in late differentiation stage （CD27-CD28-）（P＜0.05），and lower frequency of CD4+or CD8+T lymphocytes in early differentiation stage（CD27+CD28+）than high CD4/ CD8 ratio group（P＜0.05）.Besides，low CD4/CD8 ratio group had significantly lower frequency of naïve CD4+and CD8+T lymphocytes and lower frequency of CD31+naïve CD8+T lymphocytes than high CD4/CD8 ratio group（P＜0.05）.ConclusionsHIV/AIDS patients with low baseline CD4+T lymphocyte count and low baseline CD4/CD8 ratio are inclined to have relatively low CD4/CD8 ratio after receiving effective HAART，thus an early initiation of HAART is necessary to prevent the occurrence of consistently low CD4/CD8 ratio.HIV/AIDS patients with low CD4/CD8 ratio after effective HAART show more serious T lymphocyte immune activation and immunosenescence，so in addition to HAART，novel interventions should be given for ongoing immune dysfunction in such patients.

acquired immunodeficiency syndrome；HIV；lymphocyte count；T-lymphocyte subsets AIDS是由HIV感染引起的人体免疫缺陷综合征。HIV感染人体后，出现CD4+T淋巴细胞进行性减少，CD4/CD8比值倒置现象，细胞免疫功能受损。高效抗反转录病毒治疗（highly active antiretroviral therapy，HAART）常常可以显著降低HIV感染者/ AIDS患者（HIV/AIDS患者）体内HIV复制，提高CD4+T淋巴细胞的数量，重建患者免疫功能［1］。目前，人们普遍用CD4+T淋巴细胞计数的恢复情况来衡量HIV/AIDS患者对HAART的反应。

赵红心，E-mail:13911022130@163.com

10.3969/j.issn.1007-8134.2015.06.006

2014年首都卫生发展科研专项项目（2014-2-2173）；国家自然科学基金（81371804）

100015，北京大学地坛医院教学医院感染一科（张钰、田云飞、肖江、韩宁、杨涤、刘维、赵红心）