Ring-Box 1基因负调控抗病毒天然免疫的初步研究

陈宣男，陈前龙，全首祯

Ring-Box 1基因负调控抗病毒天然免疫的初步研究

陈宣男，陈前龙，全首祯

目的研究Ring-Box 1基因（RBX1/ROC1）对视黄酸诱导基因-I（retinoic acid inducible gene I, DDX58/RIG-I）抗病毒感染信号通路功能的影响，寻找抗病毒治疗的潜在靶标。方法利用PCR扩增RBX1/ROC1基因，将其插入pCDNA3载体，并且通过免疫印迹检测质粒在细胞中的表达；利用荧光素酶报告基因检测RBX1/ROC1基因对DDX58/RIG-I信号通路的影响。结果本研究成功构建Flag-RBXI/ROC1真核表达载体并在HEK293细胞中得到了表达；通过荧光素酶报告基因分析发现RBX1/ROC1基因抑制DDX58/RIG-I信号通路。结论RBX1/ROC1是宿主天然免疫DDX58/RIG-I抗病毒感染信号通路的负调控分子，为寻找抗病毒靶点打下基础。

RBX1/ROC1基因；DDX58/RIG-I信号通路；负调控

目前，抗病毒感染药物的靶标主要针对病毒自身的特殊结构设计，但是随着耐药及新发传染病的出现，以宿主蛋白为靶点的抗病毒策略应运而生。该策略基于对病毒与宿主相互作用的了解。宿主天然免疫是宿主抗感染的第一道防线，是比较明确的广谱抗病毒感染的途径[1-2]。宿主表达的模式识别受体识别病原微生物的模式相关模体，通过一系列的信号转导，激活宿主的炎症及I型干扰素信号通路。位于细胞浆中的视黄酸诱导基因-I（retinoic acid inducible gene I, DDX58/RIG-I）主要识别病毒RNA，经过一系列的信号转导，最终通过NF-κB和IRF3等转录因子，促进炎症相关分子的细胞因子和I型干扰素的转录。这些转录因子发挥了重要的抗病毒作用，同时有些蛋白参与天然免疫信号通路负调控，而降低这些负调控分子可能成为抗病毒感染新策略[3]。

RBX1/ROC1基因最初被报道与胚胎发育相关，RBX1/ROC1基因表达异常导致SCF连接酶复合物活性损失，进而引起胚胎损伤[4]。近期的研究表明RBX1/ROC1基因在肿瘤中高表达，并且促进肿瘤的发生、发展[5-6]。但是，RBX1/ROC1在宿主天然免疫DDX58/RIG-I中的作用未见报道。本研究中，首先克隆并表达了该基因，进而通过荧光素酶报告基因检测了RBX1/ROC1负调控DDX58/RIG-I信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人胚胎肾HEK293细胞和pCDNA3-Flag质粒由中国医学科学院阜外医院实验诊断中心保存。大肠杆菌DH5α感受态、胶回收试剂盒、Trizol、2×PFU PCR Mix、反转录试剂盒及质粒提取试剂盒购自天根公司；BamHⅠ、XhoⅠ等限制性内切酶购自TaKaRa公司；T4 DNA快速T4连接酶为全世金公司产品。引物合成、测序由奥科公司完成；DMEM培养基和胎牛血清为GIBCO公司产品；Flag抗体购自Sigma公司；转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司；Dual-Lucifersae reporter Assay 试剂盒购自Promega公司。

1.2 Flag-ROC1质粒构建 提取HEK293细胞的总RNA，反转录后作为PCR模板。按照RBX1/ ROC1基因的DNA序列，设计PCR引物序列如下，上游引物RBX1/ROC1-BamH I-F：GG GGATCC ATGGCGGCAGCGATGG，下游引物RBX1/ROC1-Xho I-R：GG CTCGAG CTAGTGCCCATACTTTTGGAATTC。PCR反应体系为（50 μl）：模板5 μl，上、下游引物各0.5 μl，2×PFU PCR Mix 25 μl及ddH2O 19 μl。PCR程序：94 ℃2 min；94 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃30 s，30个循环；72 ℃3 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收。回收产物和pCDNA3-Flag质粒用BamHⅠ、XhoⅠ双酶切，37 ℃过夜后，分别进行琼脂糖电泳鉴定及回收。T4连接酶连接后，转化感受态细胞。涂氨苄青霉素平板后，挑取单克隆扩增，进行菌液PCR和质粒酶切鉴定，将鉴定正确的克隆送奥科公司进行测序，测序正确的质粒命名为Flag-ROC1。

1.3 质粒转染和免疫印迹 将质粒按照转染试剂说明书，转染入细胞中。24 h后收取细胞，用NP-40细胞裂解液在冰上裂解细胞，15 min后，4 ℃离心10 min，取上清与上样缓冲液混合。配制15% SDS-PAGE胶，进行样品的电泳分离。电泳后，半干转（Bio-Rad）18 V，1.5 h，将蛋白转至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fl uoride, PVDF）膜。转膜结束后，PVDF膜用5% 脱脂奶粉室温封闭1 h； 5% 脱脂奶粉配制的一抗室温孵育1 h，TBST洗脱3次；加入5% 脱脂奶粉配制的二抗室温孵育1 h；TBST洗脱3次后，加入发光液，应用化学发光仪（天能公司）检测并记录。

1.4 荧光素酶报告基因活性分析 HEK293细胞接种于12孔板中，将质粒按图3和4所示共转染细胞。18 h后细胞用1×PBS洗2次，在每孔中加入100 μl 1×被动裂解（Promega公司试剂盒），室温裂解15 min，取上清50 μl进行荧光素酶活性测定。检测按照Promega公司试剂盒所述方法进行测定。

2 结 果

2.1 Flag-ROC1质粒的构建 本研究提取了HEK293细胞的总RNA，反转后进行PCR扩增，RBX1/ROC1为327 bp，扩增得到的片段大小与预期相符（图1A）。将扩增的RBX1/ROC1纯化、酶切后连入pCDNA3-Flag，构建了RBX1/ROC1表达质粒，命名为Flag-ROC1，通过酶切对插入序列进行了鉴定，片段大小与预期相符（预期约为327 bp）（图1B）。测序通过Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi）比对证明插入序列正确（图1C）。

图1 RBX1/ROC1扩增与pCDNA3-Flag-ROC1质粒酶切鉴定A. PCR扩增RBX1/ROC1；B. pCDNA3-Flag-ROC1质粒BamHⅠ+ XhoⅠ双酶切鉴定；C. pCDNA3-Flag-ROC1测序结果序列比对Figure 1 RBX1/ROC1 gene amplification by PCR and cloning into pCDNA3-Flag plasmid

2.2 Flag-ROC1质粒在HEK293细胞中的表达 将Flag空载体和Flag-ROC1 1 μg分别转染HEK293细胞，然后行免疫印迹，检测Flag-ROC1的表达，根据Genecard数据库给出的理论分子量，Flag-ROC1的分子量约为12 kDa，本研究结果显示Flag-ROC1转染的细胞低于15 kDa处可见阳性条带，而Flag空载体未见条带（图2），Tubulin为上样对照。

图2 Flag-ROC1在HEK293细胞的表达1. HEK293细胞转染Flag-空载体；2. HEK293细胞转染Flag-ROC1Figure 2 Expression of Flag-ROC1 in HEK293 cells

2.3 Flag-ROC1抑制DDX58/RIG-I引起的干扰素激活 DDX58/RIG-I的2CARD 结构域可以激活干扰素表达，将DDX58/RIG-1-2CARD、IFN-β-Luc、pRL及不同量的Flag-ROC1转染入HEK293中，从图3A可以看到RIG-I-2CARD（100 ng）可以激活IFN-β报告基因，而RBX1/ROC1可以抑制这一作用，分别抑制了44.8%，58.7%及80.0%，可以看到随着RBX1/ROC1量增加，抑制作用增强。分泌到细胞外的IFN-β通过与其受体结合，进一步通过JAKSTAT途径激活IFN诱导基因（interferon stimulate response element, ISRE），因此我们通过荧光素酶活性进一步检测了RBX1/ROC1对DDX58/RIG-I激活的信号通路的影响，与IFN-β报告基因结果相符，RBX1/ROC1可以抑制ISRE报告基因的激活，抑制率分别为38.2%，58.1%及77.5%（图3B）。

2.4 Flag-ROC1抑制polyI∶C引起的干扰素激活 polyI∶C是双链DNA的拟似物，转染入细胞后可以激活内源的DDX58/RIG-I信号通路。从图4A可以看到RBX1/ROC1呈剂量依赖性的抑制polyI∶C（100 ng）对IFN-β的激活（抑制率分别为43.6%，63.0%及72.7%），同样也可以抑制ISRE报告基因的激活（抑制率分别为38.37%，55.28%及71.7%）（图4B）。

图3 过表达RBX1/ROC1抑制DDX58/RIG-I的激活A. 转染不同剂量的RBX1/ROC1，检测DDX58/RIG-I激活的干扰素报告基因活性；B. 转染不同剂量的RBX1/ROC1，检测DDX58/ RIG-I激活的干扰素诱导报告基因活性Figure 3 Inhibitory role of RBX1/ROC1 on DDX58/RIG-I signaling pathway

3 讨 论

SCF E3连接酶复合物是重要的RING指型泛素连接酶家族，该复合物包含多个亚基。SCF复合物包含三种固定成分RBX1/ROC1（RING-指蛋白）、Cullin蛋白、接头蛋白以及可变组份F-盒蛋白（F-box）（与特异底物结合）。SCF E3连接酶复合物的底物包括细胞周期相关蛋白、DNA损伤修复基因、抑癌基因等[7-10]，参与癌症的发生。研究发现RBX1/ROC1基因在胃癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌等肿瘤中呈高表达。而抑制RBX1/ ROC1的表达，可以抑制肿瘤发展，因此RBX1/ ROC1可以作为肿瘤治疗的靶标[5,11]，RBX1/ROC1在DDX58/RIG-I引起的宿主天然免疫的功能尚未见报道。我们的研究初步发现了RBX1/ROC1抑制DDX58/RIG-I通路激活的I型干扰素产生，但是RBX1/ROC1是否通过SCF E3连接酶复合物发挥作用及参与该复合物的其他分子有待进一步研究。

DDX58/RIG-I是识别RNA病毒感染的重要分子，DDX58/RIG-I在平时处于抑制状态，当其与底物结合后，暴露其CARD结构域，通过CARDCARD相互作用，将信号传导给位MAVS，MAVS在线粒体上形成大的聚合物，募集TRAF3和TRAF6，进一步激活蛋白激酶TBK1和IKK复合物，促进NF-κB和IRF3等转录因子入核，促进炎症相关分子的细胞因子和I型干扰素的转录[12]。研究发现了RBX1/ROC1抑制DDX58/RIG-I通路，但是靶向DDX58/RIG-I通路中的哪个重要蛋白，仍须要进一步研究。

综上所述，我们的研究发现RBX1/ROC1是宿主天然免疫的DDX58/RIG-I信号通路负调控分子，为进一步揭示RBX1/ROC1调控宿主天然免疫的机制打下基础，并且为抗病毒和抗炎治疗提供了潜在的靶标。

图4 过表达RBX1/ROC1抑制polyI:C激活的干扰素途径A. 转染不同剂量的RBX1/ROC1，检测polyI:C激活的干扰素报告基因活性；B. 转染不同剂量的RBX1/ROC1，检测polyI:C激活的干扰素诱导报告基因活性Figure 4 The inhibitory role of RBX1/ROC1 on polyI:C induced signaling pathway

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（2017-03-02收稿 2017-04-01修回）

（本文编辑 胡 玫）

Ring-Box 1 gene negatively regulates anti-viral innate immune response

CHEN Xuan-nan*, CHEN Qian-long, QUAN Shou-zhen
Party Committee Office of Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100037, China

ObjectiveTo study the role of Ring-Box 1 (RBX1/ROC1) in regulating retinoic acid-inducible gene I (DDX58/RIG-I) mediated anti-viral signaling pathway and explore the potential therapeutic target.MethodsThe full-length RBX1/ROC1 gene was amplified by PCR and inserted it in pCDNA3 plasmid. And then, the over-expression of RBX1/ROC1 in HEK293 cells was detected by Western Blot. Finally, the regulatory role of RBX1/ROC1 on DDX58/RIG-I was detected by luciferase reporter assays.ResultsFlag-ROC1 eukaryotic expression plasmid was constracted. After transfected it into the HEK293 cells, Flag-ROC1 was expressed in these cells. We further found that RBX1/ROC1 downregulated DDX58/RIG-I signaling pathway by luciferase reporter assays.ConclusionsRBX1/ROC1 is a negative regulator of DDX58/RIG-I anti-viral signaling pathway and our study provides a potential therapeutic target of anti-viral.

RBX1/ROC1; DDX58/RIG-I; negative regulated

R392

A

1007-8134(2017)02-0091-04

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.02.006

国家自然科学基金面上项目（81470487）

100037 北京，中国医学科学院阜外医院党委办公室（陈宣男），实验诊断中心（陈前龙）；100142 北京，解放军空军总医院（全首祯）

陈宣男，E-mail: fuwaichenxuannnan@126.com

*Corresponding author, E-mail: fuwaichenxuannan@126.com