HBV突变与HBV相关慢加急性肝衰竭相关性研究

张爱民，王慧芬，李桂英，李 玉，段学章

HBV 相关慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure,ACLF）临床病情危重、发展迅速、治疗方法少，病死率高达50%～80%[1]。机体感染HBV 后可有不同的临床结局，由病毒、肝细胞和宿主免疫系统相互作用决定。HBV 感染后的发病机制是免疫诱导的肝细胞损伤[2]，ACLF 则可能是这种免疫应答的异常反应[3]。因此，病毒及机体免疫反应就成为乙型肝炎发病机制的两个主要因素。截止目前，病毒或免疫因素如何作用导致肝衰竭的发生仍然没有明确的定论，HBV 突变是当下研究热点[4-5]。本研究选取87例HBV 相关ACLF 患者为研究对象，以52例慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）、51例肝硬化（liver cirrhosis,LC）为对照，对HBV 前C（pre-core,PC）区、C 区、基本核心启动子（basal core promoter,BCP）区的13 个基因位点进行测序，对比不同患者之间PC 区、C 区和BCP 区核苷酸突变率的差异，探讨其与ACLF 之间的相关性。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2010年1月—2012年4月于我院住院诊治的慢性HBV 感染者190例。所有患者均为血清HBV DNA 阳性，未曾进行干扰素和（或）核苷（酸）类似物抗病毒治疗，经病史及实验室检查明确为感染6 个月以上。排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒重叠感染；排除合并CMV、EB 病毒和HIV 感染；排除合并自身免疫性肝炎、脂肪肝及酒精性肝病。肝衰竭诊断符合2006年《肝衰竭诊疗指南》[6]，慢性肝炎及肝硬化诊断符合2010年《慢性乙型肝炎防治指南》[7]。

1.2 实验室检测

1.2.1 生化及病毒学指标检测 患者肝功能（ALT、AST、TBIL 和ALB）、凝血功能（PT、PA 和国际标准化比值）、HBV M 及HBV DNA 定量检测等为住院期间由我院临床检验医学中心完成。

1.2.2 HBV 基因型、亚型和PC 区、C 区、BCP 区突变位点的检测

1.2.2.1 引物设计与合成 根据HBV 基因组文库数据，采用Primer 5.0 软件，针对S 基因保守区共设计2 对巢式引物对HBV 进行分型。对B 和C 亚型采用半巢式，突变位点为巢式引物，引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（表1）。

1.2.2.2 基因组DNA 提取和PCR 扩增

表1 HBV 基因分型和突变位点的引物序列Table1 HBV genotype classification and gene mutation primers

1.2.2.2.1 标本采集和保存 上述标本均取自患者外周静脉血，干燥管静置2 h，以3000 r/min 离心10 min，分离血清分装于1.5 ml EP 管中，保存于-80 ℃冰箱，统一检测。

1.2.2.2.2 基因组DNA 提取和PCR 扩增 参照Tiangen 试剂盒说明，取先证者及其12 名家系成员外周静脉血。提取全血白细胞基因组DNA，-20 ℃保存。基因组DNA 模板行PCR 扩增。反应体系包括：基因组DNA 50 ng、上下游引物各0.5 μl（10 pmol）、dNTP（2.5 mmol）2 μl、rTaq 酶（TaKaRa 公司，日本）1 U、2×GC buffer Ⅰ缓冲液补充双蒸水至20 μl。PCR 应用ABI 9700 热循环仪，条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环35 次，72 ℃再延伸10 min。

1.2.2.3 PCR 产物纯化、测序及序列分析 PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，纯化后分别对扩增引物测序（北京华大基因研究中心），结果采用DNAStar 软件子程序SeqMan 分析。

1.3 统计学处理 采用Stata 11.0 软件对数据进行分析。正态分布的连续性数据如年龄、HBV DNA 用±s 表示，非正态分布的连续性数据如血清胆红素、ALT、PA 水平用中位数（最小值，最大值）表示。3 组间率的比较采用R×C χ2检验，两两多重比较用Scheffe 法。发生ACLF 影响因素用logistic 回归分析。P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般资料 190例慢性HBV 感染者中包括52例CHB（CHB 组）、51例LC（LC 组）和87例ACLF（ACLF 组）。患者年龄、性别、入组时肝功能和凝血功能等见表2。

2.2 190例BCP 区、前C 区和C 区基因突变分布 检测190例的BCP 区、前C 区和C 区基因突变位点为1753（T→C/G）、1754（T→C）、1758（T→C）、1762（A →T）、1764（G →A）、1766（C →T）、1768（T→A）、1846（A →T）、1858（T→C）、1862（G →T）、1896（G→A）、1899（G→A）和1913（C→A/G）。CHB组的全阴数为12例（23.1%），远远大于LC 组和ACLF 组的0例（0%）和3例（3.5%）。CHB、LC、ACLF 3 组的13 个突变位点的总突变数分别为120、181、335 个，人均核苷酸突变检出率分别为2.31、3.55、3.86 个。ACLF 组 中T1754G、T1758C、C1766T、T1768A、G1862T、T1858C 发生突变的病例数分别为7、5、7、4、1、4例，故未对这6 个位点的突变情况进一步分析统计。T1753C、A1762T、G1764A和G1899A 这4 个突变位点，LC 组核苷酸突变率高于CHB 组。A1762T、A1846T、G1899A 和C1913（A/G）4 个突变位点在ACLF 组和CHB 组之间差异均有统计学意义，CHB 组核苷酸突变率低于ACLF组。G1764A、A1846T 和C1913（A/G）在ACLF 组和LC 组之间差异有统计学意义，G1764A 位点突变率在LC 组高于ACLF 组，A1846T 和C1913（A/G）位点突变率在LC 组低于ACLF 组（表3）。

表2 CHB、LC 和ACLF 组临床及病毒学特征Table2 Clinical and virological characteristics in patients with CHB,LC and ACLF

按患者在慢性肝炎或肝硬化基础上发生ACLF，分为ACLF-CHB 组和ACLF-LC 组，分别为29例和58例，比较CHB 组和ACLF-CHB 组、LC组和ACLF-LC 组基因突变差异。结果提示A1846T和C1913（A/G）位点突变率在CHB 组低于ACLFCHB 组，在LC 组低于ACLF-LC 组（表4）。

表3 CHB、LC 和ACLF 组HBV 基因突变比较［例(%)］Table3 Comparison of HBV mutations among patients with CHB,LC and ACLF [cases (%)]

2.3 ACLF 发病影响因素的多因素分析 将HBeAg 是否阳性、HBV 基因分型是否为C 型及是否发生1753（T→C/G）、1762（A→T）、1764（G→A）、1846（A→T）、1899（G→A）和1913（C→A/G）位点突变设为自变量，是否发生ACLF 为因变量，进行logistic 回归分析。自变量赋值如下：X1（HBeAg 阳性=1、阴性=0），X2（HBV 基因C 型=1、B 型=0），X3［1753（C/G）=1、1753T=0）］，X4（1762T=1、1762A=0），X5（1764A=1、1764G=0），X6（1846T=1、1846A=0），X7（1899A=1、1899G=0），X8（1913A/G=1、1913C=0），Y（发生ACLF=1、不发生ACLF=0）。结果表明1846（A→T）和1913（C→A/G）的OR 值分别为2.86 和5.93，均为发生ACLF 的危险因素（P＜0.05）。见表5。

表4 CHB 组与ACLF-CHB、LC 与ACLF-LC 组HBV 基因突变比较［例(%)］Table4 Comparison of HBV mutations between patients with CHB and ACLF-CHB,and between LC and ACLF- LC[cases (%)]

表5 ACLF 发病相关多因素分析Table5 Multivariable analysis of the occurrence of HBV-related ACLF

3 讨 论

HBV 基因突变是CHB 疾病进展过程中在宿主的免疫压力下病毒的正向选择结果，突变株一般可减少病毒蛋白的产生，是病毒逃避免疫监视的一种方式[8]。由于这种机制，HBV 突变随着疾病的进展逐步累积，以致不同疾病阶段突变率明显不同[9]。本研究显示CHB 组野生型HBV 占23.1%，远远大于LC 和ACLF 组的0%和3.5%。CHB、LC和ACLF 3 组的人均HBV 核苷酸突变检出率分别为2.31、3.55 和3.86 个。

关于HBV 的PC 区突变株感染与肝脏病变轻重的关系意见不一，大多数报道认为突变与肝脏病变程度相关，尤其与肝衰竭的发生密切相关[10-12]。本研究显示PC 区G1899A 位点突变在LC 和ACLF组高于CHB 组，但3 组间差异无统计学意义。BCP区突变影响病情的报道较多，本研究中A1762T 和G1764A 位点突变率LC 组高于CHB 组，G1764A 位点突变率LC 组高于ACLF 组，但CHB 组和ACLF组G1764A 位点突变率比较差异无统计学意义，故考虑G1764A 位点突变与肝硬化相关，并不影响ACLF 的发生。A1846T 和C1913（A/G）位点突变率在CHB 组和LC 组均低于ACLF 组，但在CHB 组和LC 组间差异无统计学意义。按ACLF 发病基础分为ACLF-CHB 和ACLF-LC 2 组，分别比较CHB组和ACLF-CHB 组、LC 组和ACLF-LC 组，结果同样发现A1846T 和C1913（A/G）位点突变率在CHB组低于ACLF-CHB 组，LC 组低于ACLF-LC 组，故推测可能A1846T 和C1913（A/G）位点突变与ACLF有关。为进一步排除干扰因素，找出对ACLF 有意义的预测因素，我们对上述单因素分析有统计学意义的指标引入二项分类的logistic 回归，应变量为是否发生ACLF。引入分析的指标有：HBeAg 状态、HBV 基因分型、1753（T→C/G）、1762（A→T）、1764（G→A）、1846（A→T）、1899（G→A）和1913（C→A/G）。结果提示1846（A→T）和1913（C→A/G）位核苷酸突变是预测ACLF 的有效指标，OR 值分别为2.86 和5.93，提示1846（A→T）和1913（C→A/G）位点突变患者发生ACLF 的几率分别是未发生突变患者的2.86 和5.93 倍。前期研究显示A1846T 突变与肝脏炎症及ACLF 发病有关[13-14]，相关发病机制尚不清楚。nt1913 位于C 区起始部位，既往对此位点突变的相关文献较少。由于该位点突变可引起HBcAg 第5 位氨基酸的突变（脯氨酸→苏氨酸/丙氨酸），该氨基酸位于HBcAg 人类白细胞分类抗原Ⅱ限制性辅助性T 细胞抗原表位，故nt1913 突变可能会引起该表位的变化，从而影响病情的严重程度[15-17]。

总之，ACLF 患者血清HBV 发生A1846T 和C1913（A/G）突变较CHB 和LC 患者更多，这一发现有助于了解不同肝病基础上发生ACLF 的发病机制，并可能有助于预测慢性肝病是否发展为ACLF，但须进一步进行体外实验来支持这一可能发病机制。

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