不同形式的HIV DNA与疾病进展的相关性分析

姜太一，李红艳，张 彤，吴 昊，焦艳梅

HIV 感染过程中，HIV RNA 基因反转录为病毒DNA，线状的双链HIV DNA 以整合前复合物的形式转到细胞核内。然后，在宿主整合酶的作用下，一些线状的双链HIV DNA 随机整合到宿主细胞基因组内。也有一些线状的HIV DNA 未整合进宿主内，在线粒体外形成1 个长末端重复序列（long terminalrepeat,LTR）和2 个LTR 的环状HIVDNA[1-2]。对于环状HIV DNA 是否能够长期稳定存在目前尚有争议。

HIV RNA 定量是目前评价HIV 感染疾病进展的重要指标，在临床上被广泛应用。据文献报道，在HIV 感染早期，外周血中HIV DNA 的水平也可作为预测疾病进展的重要指标[3-5]。这些研究进一步说明研究急性期HIV DNA 水平与疾病进展的相关性，有利于进一步揭示HIV 的致病机制。虽然有研究证实HIV DNA 与疾病进展密切相关，但哪种形式的HIV DNA 与疾病进展关系最密切目前尚无报道。本研究旨在探讨不同形式的HIV DNA 的动力学变化特点及其与疾病进展的关系。

1 对象与方法

1.1 对象 选择2006年1月—2012年12月首都医科大学附属北京佑安医院规律随诊的男同性恋HIV/AIDS 患者，诊断标准参照《艾滋病诊疗指南（2011 版）》[6]，所有病例均经蛋白印迹试验确证为HIV 感染。共入组48例，均未接受过抗病毒治疗。根据Fiebig 分期评估患者的感染时间[7]，并按照评估的感染时间，将患者分为≤60 d 组、60～90 d 组和90～365 d 3 组。本研究方案经本院伦理委员会批准，所有受试者均于采血前签署知情同意书。患者一般情况见表1。

1.2 外周全血DNA 提取 采用德国Qiagen 公司生产的DNA 提取试剂盒提取外周血中的DNA，具体操作方法参照试剂盒说明书。

1.3 实时定量PCR 检测 采用ABI7900 实时定量仪（美国应用生物系统公司）、改良型RPMI-1640培养基（HyClone 公司，美国）、聚蔗糖-泛影葡胺分层液（淋巴细胞分离液，Ficoll，天津）和DNA 提取试剂盒（Qiagen 公司，德国）。实时定量PCR 引物及探针的设计主要参考文献[8]，引物及探针由美国应用生物系统公司合成，具体引物及探针见表2。PCR反应条件：首先95 ℃10 min，然后95 ℃15 s 变性，60 ℃1 min 退火及延伸40 个循环。

表1 患者一般情况Table1 General data of the enrolled patients

表2 所用的引物或探针Table2 Used primers or probes

1.4 CD4+T 淋巴细胞计数检测 取新鲜全血50 μl，放入专用的CD4+T 淋巴细胞绝对计数管中，加入CD3-FITC/CD4-PE/CD8-Percp 抗体，混匀后室温避光孵育15 min，加入450 μl 免洗溶血素，充分混匀，室温避光15 min 后上机，采用MultiSET 软件自动计数系统检测CD4+T 淋巴细胞绝对计数。

1.5 血浆HIV 载量的检测 采用RNA 提取试剂盒提取血浆病毒RNA 后，利用罗氏HIV 定量检测试剂盒（1.5 版本）检测HIV 载量，检测灵敏度为50 copies/ml 血浆。具体RNA 提取及定量检测操作方法均严格按照试剂盒说明书进行。

1.6 统计学处理 实验数据采用SPSS 11.5 软件进行分析处理。多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用q 检验。各种形式的HIV DNA 与CD4+T 淋巴细胞计数及病毒载量之间的相关性采用Spearman 秩相关性分析。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同形式的HIV DNA 与疾病进展之间的相关性分析 总的HIV DNA 与病毒载量成中等程度正相关（r=0.485），与CD4+T 淋巴细胞计数呈弱负相关（r=-0.386）。整合的HIV DNA 与病毒载量无相关性，与CD4+T 淋巴细胞计数呈弱负相关（r=-0.346）。2 个LTR 的环状HIV DNA 与病毒载量和CD4+T 淋巴细胞计数均无相关性。见表3。

表3 不同形式的HIV DNA 与病毒载量及CD4+ T 淋巴细胞计数的相关系数[r(P)]Table3 Correlation coefficient of the different forms of HIV DNA and viral loads and CD4+ T lymphocyte counts [r (P)]

2.2 病毒载量不同水平组HIV DNA 比较 根据病毒载量的水平将患者分为3 组：病毒载量＞105copies/ml 组（高病毒载量组）、104～105copies/ml 组及103～104copies/ml 组（低病毒载量组），每组各16例。高病毒载量组总的HIV DNA 明显高于低病毒载量组（P=0.043），其整合的HIV DNA 亦高于104～105copies/ml 组（P=0.032）。2 个LTR 的环状HIV DNA在3 组间差异无统计学意义。见图1。

2.3 CD4+T 淋巴细胞不同水平组HIV DNA 比较 根据CD4+T 淋巴细胞水平将患者分为3 组：CD4+T淋巴细胞＞500 个/mm3组（高CD4 组）、350～500个/mm3组和＜350 个/mm3组（低CD4 组）。低CD4组整合的HIV DNA 明显高于350～500 个/mm3组和高CD4 组（P 分别为0.027、0.000），其总的HIV DNA 亦高于350～500 个/mm3组和高CD4 组（P 分别为0.048、0.006）。2 个LTR 的环状HIV DNA 在3组间差异无统计学意义。见图2。

图1 病毒载量不同水平组HIV DNA 比较Figure1 Comparison of HIV DNA among the groups with different viral loads

图2 CD4+ T 淋巴细胞不同水平组HIV DNA 比较Figure2 Comparison of HIV DNA among the groups with different CD4+ T lymphocyte counts

2.4 不同感染时间组HIV DNA 比较 ≤60 d 组、60～90 d 组和90～365 d 组3 组间整合的HIV DNA差异无统计学意义。随着感染时间的延长，总的HIV DNA 及2 个LTR 的环状HIV DNA 均增加。90～365d 组总的HIV DNA 明显高于60～90 d 组和≤60 d 组（P 分别为0.004、0.035），其2 个LTR 的环状HIV DNA 亦高于60～90 d 组（P=0.003）。见图3。

图3 HIV 不同感染时间组HIV DNA 比较Figure3 Comparison of HIV DNA among the groups with different HIV infection time

3 讨 论

目前，HIV RNA 是评价HIV 感染疾病进展及疗效的重要指标[9]。对于HIV DNA 与疾病进展之间的关系目前研究存在争议。一些研究认为整合的HIV DNA 是与疾病进展关系最密切的指标[10]；有一些研究则认为2 个LTR 的环状HIV DNA 与疾病进展关系最密切，是反映病毒复制的重要指标[11]；还有一些文献报道整合的HIV DNA 是反映病毒复制及疾病进展的重要指标[12-14]。研究存在差异的重要原因可能是患者的差异及采用的定量方法不同。在本研究中，我们采用Butler 等[8]报道的对HIV DNA 进行定量的方法对48例HIV/AIDS 患者进行HIV DNA 检测。结果表明，总的HIV DNA 与疾病进展的关系最密切，相反，2 个LTR 的环状HIV DNA 与疾病进展无相关性。一些文献报道2 个LTR 的环状HIV DNA 是最新HIV 复制的标志[11]，另有文献报道其半衰期较短，在复制过程中它不稳定[15]。有研究认为整合的HIV DNA 是潜伏HIV 存在的重要形式[16]。我们的研究结果表明，整合的HIV DNA 相对较稳定，与疾病进展具有一定的相关性。因为总的HIV DNA 包括了各种形式的HIV DNA，所以单一的某种形式的HIV DNA 与疾病进展之间的关系都是片面的。

总之，我们的研究发现总的HIV DNA 与疾病进展的关系最密切，此研究将对于进一步揭示不同形式HIV DNA 的作用有重要意义。

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