腺病毒载体在慢性肝病治疗中的研究进展

赵启全，简 丽，贾 蓓，黄文祥

肝炎、肝炎肝硬化及肝癌等慢性肝病严重危害人类健康，通过基因治疗手段预防和减轻肝损伤是近年研究的新方向。腺病毒载体转基因效率高，体外实验通常接近100%的转导效率；可转导不同类型的人组织细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞所限；容易制得高滴度病毒载体，在细胞培养物中重组病毒滴度可达1013VP/ml；进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，安全性高。因此，腺病毒载体在基因治疗临床试验方面得到越来越多的应用，成为继反转录病毒载体之后广泛应用且最具前景的病毒载体。研究显示，腺病毒载体介导的基因可在肝脏高效表达且未见明显的肝损伤，因此在基因治疗中腺病毒载体可作为治疗慢性肝病的安全有效的基因传递系统[1]。腺病毒载体用于慢性肝病生物治疗的研究必将促进慢性肝病生物治疗向临床应用的深入发展。本文就腺病毒载体在慢性肝病治疗中的进展进行综述。

1 腺病毒载体

腺病毒1953年由Rowe 等从健康人腺体组织的细胞培养中发现，其毒粒为无包膜的DNA 病毒，病毒颗粒直径为60～80 nm，基因组为双螺旋线形DNA，长约36 kb，可分为100 个基因图距单位，两端各有1 个100～150 bp 反向末端重复序列（inverted terminal repeats,ITR）[2]。基因组左端（194～385 bp）载有病毒包装信号，ITR 和包装信号是腺病毒基因组复制和包装必不可少的顺式作用元件。根据病毒DNA复制先后顺序，可将基因组分为早区（E 区）和晚区（L 区），前者有E1、E2、E3 和E4 4 个区，编码病毒调节蛋白；后者有L1、L2、L3、L4 和L5 共5 个区。目前腺病毒载体大多以血清型5 型（AdH5）和AdH2为基础。

腺病毒载体作为目前最常用的生物治疗载体之一，具有包装容量大，感染效率高，外源基因表达水平较高且相对较安全等优点。但也存在一些不足，如免疫原性较强，用量较大时有一定的毒性，不能持续表达所需产物及须重复给药等，从而在一定程度上制约了临床应用。因此，各国学者正在通过不同方式对腺病毒载体进行改造，以降低其免疫原性，增加外源基因表达。

一般将E1 或E3 基因缺失的腺病毒载体称为第一代腺病毒载体，此类型载体可引发机体产生较强的炎症反应和免疫反应，表达外源基因时间短。E2 或E4 基因缺失的腺病毒载体被称为第二代腺病毒载体，其产生的免疫反应较弱，载体容量和安全性方面亦改进许多。第三代腺病毒载体则缺失了大部分腺病毒基因（微型腺病毒载体），仅保留了两端包装信号序列，最大可插入35 kb 的基因，病毒蛋白表达引起的细胞免疫反应进一步减少，载体中引入核基质附着区基因可使外源基因保持长期表达，并增大了载体的稳定性。但这一载体系统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。

2 腺病毒载体在慢性肝病生物治疗中的研究应用

2.1 腺病毒中和抗体的流行性调查 腺病毒是人急性呼吸道感染的主要病原之一，也可作为基因工程疫苗载体，但存在一定的免疫原性。腺病毒目前采用AdH5 作为载体较为普遍，相关研究也较多。几乎所有人在幼年时期都感染过AdH5，美国成年人中AdH5 的中和抗体阳性率为30%～50%，在幼儿以及亚洲和非洲的一些国家中流行性较强[2-7]。Barouch 等[8]对腺病毒中和抗体调查发现，在南非、肯尼亚、乌干达和泰国腺病毒AdH26 中和抗体阳性率分别为43.1%～53.2%、66.2%、67.8%和54.6%；AdH35 中和抗体阳性率分别为10.6%～17.8%、14.8%、5.4%和17.1%；AdH48 中和抗体阳性率分别为13.3%～24.6%、51.0%、50.0%和12.8%；AdH5 中和抗体阳性率分别为87.9%～89.5%、90.5%、86.4%和82.2%。2011年对广州市278 名健康人群和32例HIV 感染者AdH5 的流行病学情况调查发现，AdH5 广泛用于疫苗载体和基因治疗，但存在高比例的免疫原性，在健康人群中的阳性率达77.34%，在42～71 岁人群中甚至达到84.80%[9]。2007年苏晓波等[10]对广州地区AdH5 的流行病学调查结果得出，成人AdH5 中和抗体阳性率为26.72%，儿童为17.02%。因此，目前各国AdH5 中和抗体阳性率均较高，有利于基于此的疫苗开发，但不适于基因治疗，有必要开发寻求其他基因型的腺病毒载体用于基因治疗。

2.2 腺病毒载体在肝炎生物治疗中的应用 腺病毒载体在肝炎治疗方面主要为介导核酶对HBV 基因表达的抑制作用，介导RNA 干扰在抗HBV 研究中的应用以及在治疗性乙型肝炎疫苗研究中的应用等[11]。有关人抗黏液病毒基因的重组腺病毒研究提示，人抗黏液病毒A 基因重组腺病毒在体外具有抗HBV 的作用[12]。刘燕等[13]研究重组腺病毒肝细胞生长因子对HBV 感染滋养层细胞的抑制作用，结果显示肝细胞生长因子可有效抑制HBV 感染滋养层细胞。HBV 感染与肝癌的发生密切相关，而HBVx基因编码的HBx 蛋白在HBV 相关肝癌的发生发展中起关键作用[14]。史震等[15]采用pAdEasy 重组腺病毒系统，构建HBx 基因重组腺病毒载体，为进一步研究HBx 基因对肝癌发展的影响提供可靠的基因转移工具。生物治疗是一种前景十分好的抗HBV治疗手段，但要真正实现生物治疗的临床应用还须相关方面的更深入研究。HCV 重要编码蛋白重组腺病毒载体的构建，也为进一步研究丙型肝炎基因免疫和基因治疗奠定了基础[16-17]。

2.3 重组腺病毒的构建用于肝硬化大鼠的研究 邓刚等[18]探讨持续活化蛋白激酶B 且带HA 标签（myr-HA-Akt）基因的重组腺病毒在肝硬化大鼠肝脏中的表达特性，构建的重组腺病毒Ad-myr-HAAkt 能有效感染肝硬化模型大鼠，并可在其体内正确转录和翻译，为进一步研究腺病毒介导的Akt 基因对肝硬化的治疗奠定了实验基础。肝硬化大鼠肝内Akt 和eNOS 的活化均受到抑制，其结果是NO生成减少而肝内血管阻力增大，表现为门静脉压力升高。基于这一现象，黄飞舟等[19]以复制缺陷型腺病毒为载体，经尾静脉注射途径将编码持续活化Akt 的基因导入肝硬化大鼠肝内，3 d 后即能使受到抑制的Akt 和eNOS 磷酸化得到恢复，同时可检测到肝内NO含量增加，门静脉压力降低。提示以腺病毒介导的靶向Akt 基因治疗肝硬化门静脉高压症可行。

2.4 腺病毒载体在肝癌生物治疗中的研究应用 目前还缺少合适的治疗肝癌的方法，国内外有不少关于腺病毒载体对肝癌治疗的研究：Wu 等[20]成功构建含Cx43 基因的重组腺病毒pAd-Cx43-IRES2-EGFP，为肿瘤治疗奠定了基础；Chen 等[21]通过整合AdH5、AdH35 及p53 基因构建的SG635-P53 新型溶瘤腺病毒载体具有选择性杀伤肝癌细胞的能力，并有较高的安全性，在肝癌治疗方面有良好的应用前景。腺病毒携带凋亡素和内皮抑素双基因对小鼠肝癌细胞增殖及凋亡的影响提示，其能显著抑制小鼠肝癌细胞生长并诱导其凋亡，有望用于肝癌的基因治疗[22]。孙璟等[23]构建的携带目的基因的重组腺病毒在人肝癌细胞株内外能有效表达。重组人p53腺病毒（rAd-p53）是肿瘤基因治疗药物，由健康人肿瘤抑制基因p53 和重构的AdH5 重组而成。通过观察rAd-p53 注射液瘤内注射对肝癌细胞的作用发现，其对肝癌有明显的抑制作用[24]。目前，腺病毒载体应用于肝癌治疗的相关研究较多[25-27]，rAdp53 注射液甚至已用于多种实体性恶性肿瘤，如肺癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌及前列腺癌等的临床研究和治疗[28-32]。虽然大部分肝癌基因治疗尚处于细胞实验及动物实验阶段，其临床应用尚未成熟，但是，相信随着分子生物学和生物技术的发展，以腺病毒载体进行的肝癌基因治疗会成为有效的途径之一。

3 结 语

虽然腺病毒载体因转导效率高，外源基因表达水平较高以及相对较安全等优点被广泛应用于生物治疗研究，又因其具有一定的嗜肝性被肝病研究者青睐[33-35]，但还有很多技术问题须要解决（如生物毒性及表达持续时间等）。当务之急是如何降低免疫原性及细胞毒性[36]，要真正实现生物治疗的临床应用还须进行相关方面更深入的研究[37]。对腺病毒载体的一系列改造可能是一条重要途径，如对六邻体蛋白的改造和对病毒衣壳进行聚乙二醇化处理，使腺病毒载体可逃逸人体的免疫识别[38]。随着对腺病毒分子生物学研究的进一步深入及肝病发病机制的全面了解，开发能够应用于临床治疗慢性肝病的重组腺病毒制剂的前景十分乐观。

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