恶性脑膜瘤组织中转录因子GATA结合蛋白4、微小RNA-195表达水平及其对预后影响

符方旭， 李庆志， 王 栋

1.文昌市人民医院 全科医学科，海南 文昌 571300；2.海南省人民医院 神经外科，海南 海口 570311

脑膜瘤是较常见的颅脑肿瘤，在各类颅脑肿瘤中，脑膜瘤占比高达30%，临床针对恶性脑膜瘤患者主要采用立体定向放疗、手术等治疗方式，但约50%的患者因病理级别高、肿瘤部位特殊、手术并发症等因素导致预后欠佳[1]。因此，临床需筛选可靠的肿瘤标记物，进一步掌握脑膜瘤发病机制，以便早期诊断与治疗，及时对肿瘤进展进行预测，改善预后。有研究发现，细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E作为细胞周期相关蛋白，可促进细胞增殖，但二者对肿瘤预后评估的效果尚不够理想[2]。转录因子GATA结合蛋白4(GATA-binding protein 4，GATA4)与肿瘤疾病的发生、进展密切相关，可通过结合下游靶基因，抑制或激活转录，从而调控蛋白表达水平，参与疾病进程[3]。微小RNA(microRNA，miR)与肿瘤疾病发生、转移、增殖有关，特异性的miR能通过调控靶基因，发挥抑癌或癌基因作用[4-5]。有研究发现，miR-195能下调胰岛素样生长因子1受体，抑制胶质母细胞瘤细胞的迁移与增殖，提示miR-195在肿瘤疾病中可能发挥重要作用[6]。本研究旨在探讨恶性脑膜瘤组织中GATA-4、miR-195表达水平，分析其与患者预后的关系，旨在为该病治疗提供新思路与新靶点。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取文昌市人民医院自2015年5月至2019年5月收治的110例恶性脑膜瘤患者为研究对象，取脑膜瘤组织、瘤旁组织进行检测。其中，男性43例，女性67例；年龄范围43～69岁，年龄(56.49±11.25)岁；世界卫生组织(World Health Organization，WHO)病理分级，Ⅱ级41例，Ⅲ级69例；脑膜瘤直径范围1～6 cm，脑膜瘤直径(3.43±1.25)cm；肿瘤部位，额部49例，蝶骨嵴36例，岩骨斜坡15例，其他10例；上皮型53例，纤维型19例，过渡型27例，其他11例；颅外转移47例。纳入标准：年龄≥18岁；患者均行手术治疗，通过手术病理确诊为恶性脑膜瘤；意识清醒，认知功能正常；术前及术后CT、MRI资料保存完整。排除标准：术前有化疗、放疗史；术前有颅脑外伤史；既往有颅脑手术史；有肝、肾、心等重要脏器损害；患有艾滋病、病毒性肝炎等传染性疾病；无法获取病理组织与癌旁组织。本研究经医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 GATA4检测 采用免疫组化法检测GATA4表达水平。(1)分别取脑膜瘤组织、瘤旁组织制备切片，存放在5℃环境中备用。(2)切片染色：脱蜡，将切片置于二甲苯溶液浸泡20 min；苏木精浸泡染色至少5 min；酸性液、碱性液分别浸泡；清水冲洗1～2 h，置于蒸馏水5 min；行伊红染色3～5 min；二甲苯透明；封片，干燥后备用。(3)链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结染色：脱蜡，依次在无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、85%乙醇内浸泡，并经磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)冲洗20 min；行抗原修复，在高压、高温状态下反应20 min，水温≥98℃，然后冷却，经PBS液冲洗10 min；取5%双氧水加入，40℃反应20 min；经羊血清封闭液将非特异性抗体封闭，37℃反应10 min；加入50 μl一抗，4℃反应24 h，经PBS液冲洗15 min；滴加二抗，在室温下放置30 min，经PBS液冲洗20 min；在显微镜下，按照所需染色程度选择性二氨基联苯胺(diaminobenzine，DAB)染色；行苏木精染色5 min；经稀盐酸、无水乙醇分别浸泡1 min，清水冲洗5 min；干燥后进行封片。(4)结果判定标准[7]：利用显微镜观察细胞计数，每个结果图像均随机选取5个视野，分析100个细胞内阳性细胞计数，胞质颜色为棕褐色、棕黄色、淡黄色则为阳性。染色强度计分，无染色、淡黄、棕黄或褐色、深褐色分别计0、1、2、3分。阳性细胞占比计分，阳性细胞<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、阳性细胞>75%分别计0、1、2、3、4分。二者积分乘积为0分提示阴性，1～2分、3～5分、积分乘积>5分则分别为弱阳性、阳性、强阳性。

1.2.2 miR-195检测 利用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)法检测miR-195表达水平。根据说明书提取RNA，测定RNA浓度、纯度后，将RNA逆转录成cDNA，存放至-30℃冰箱备用。扩增引物设计如下：miR-195上游序列为5′-CGTAGCAGCACAGAAAT-3′， miR-195下游序列为5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；以U6作为内参基因，上游序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游序列为3′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-5′。反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性15 s，60℃延伸15 s，72℃退火15 s，进行40个循环。以2-ΔΔCt值表示miR-195的相对表达量。

1.3 观察指标 分析不同GATA4、miR-195表达情况患者临床病理特征。患者术后随访24个月，通过电话或微信方式进行，每间隔3个月随访1次，在此期间，患者根据医嘱入院复查，观察病情变化，分析影响恶性脑膜瘤患者预后的危险因素。

2 结果

2.1 GATA4、miR-195表达情况比较 免疫组化结果显示，脑膜瘤组织可见明显的棕黄、棕褐色染色，表明阳性细胞较多，见图1；瘤旁组织中染色不明显，表明阳性细胞较少，见图2。脑膜瘤组织中GATA4阳性表达率高于瘤旁组织，miR-195表达量低于瘤旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

图1 GATA4在脑膜瘤组织中表达(苏木精-伊红染色法×400)

图2 GATA4在瘤旁组织中表达(苏木精-伊红染色法×400)

表1 GATA4、miR-195表达情况/例(百分率/%)

2.2 GATA4表达与恶性脑膜瘤患者病理特征关系 GATA4阳性患者WHO病理Ⅲ级、颅外转移占比高于GATA4阴性患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 GATA4表达与恶性脑膜瘤患者病理特征关系/例(百分率/%)

2.3 miR-195表达与恶性脑膜瘤患者病理特征关系 根据恶性脑膜瘤患者瘤体组织中miR-195表达均值(0.69±0.14)分为miR-195低表达(n=51，miR-195<0.69)与miR-195高表达(n=59，miR-195≥0.69)。miR-195高表达患者WHO病理Ⅲ级、颅外转移占比低于miR-195低表达患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 miR-195表达与恶性脑膜瘤患者病理特征关系/例(百分率/%)

表4 恶性脑膜瘤患者预后影响因素的COX单因素分析

2.4 恶性脑膜瘤患者预后影响因素分析 COX单因素分析显示，WHO病理Ⅲ级、脑膜瘤直径≥3 cm、颅外转移、GATA4阳性、miR-195高表达可能与预后有关(P<0.05)。COX多因素分析显示，WHO病理Ⅲ级、颅外转移、GATA4阳性是患者预后的危险因素，miR-195高表达是患者预后的保护性因素(P<0.05)。见表5。

表5 恶性脑膜瘤患者预后影响因素的COX多因素分析

3 讨论

脑膜瘤多以良性为主，恶性脑膜瘤即病理学上出现明显类高级别肉瘤、类黑色素瘤、类癌等恶性表型特征的脑膜瘤，其发生原因较复杂，可能与抑癌基因突变、染色体缺失等有关[8]。在恶性脑膜瘤中，颅底肿瘤的手术难度大，复发率达15.5%，甚至有患者出现术后永久性神经功能障碍[9]。为改善患者预后，临床需寻求可靠的肿瘤标记物，以便提供针对性干预方案。有研究报道，GATA4与肿瘤疾病发生有关且作用机制复杂，其在部分肿瘤中起抑癌作用，如肝癌、肺癌等，但在肝母细胞瘤中具有癌基因作用，促进癌细胞生长[10-11]。miR-195在结直肠癌细胞中呈低表达，可能通过阻断Notch通路，参与结直肠癌进展[12]。

GATA4是GATA家族的一员，能引起上皮特异性标志物失表达，在不同恶性肿瘤中表达水平存在差异。GATA4在多种癌细胞中具有抑癌作用，其能抑制乳腺癌患者的核转录因子-kB信号转导途径，从而抑制癌细胞增殖，是预后的保护性因素，且乳腺癌组织中GATA4表达水平低于邻近组织[13]。而GATA4在鼻咽癌组织中的甲基化频率非常低，在鼻咽癌组织中呈高表达[14]。由此可见，GATA4具有抑癌、促癌两种作用。本研究结果显示，脑膜瘤组织中GATA4以阳性表达为主，提示GATA4在脑膜瘤中发挥促癌作用，其可能通过调控特异性基因，发挥癌基因作用，对癌细胞分化、增殖进行诱导，促进肿瘤发生与进展。

张玉虹等[15]研究发现，子宫内膜癌患者血浆miR-195表达量下调，且其在瘤体组织内表达较瘤旁组织降低，提示其可能具备某种抑癌基因活性。郭芳等[16]研究提示，miR-195能通过靶向调节Raf1抑制口腔鳞癌细胞增殖，并诱导细胞凋亡，这可能是miR-195抑癌的机制之一。本研究结果显示，脑膜瘤组织中miR-195表达量低于瘤旁组织，提示miR-195具有抑癌作用。

恶性脑膜瘤患者GATA4、miR-195表达可能与多种因素有关。本研究结果显示，GATA4阳性及miR-195低表达患者的WHO Ⅲ级、颅外转移占比明显增高。WHO分级越高，颅外转移风险越大，肿瘤侵袭性越强，而GATA4在恶性脑膜瘤中呈特异性高表达，miR-195则呈低表达，过表达的GATA4以及低表达的miR-195在恶性脑膜瘤病理进展、颅外转移中均发挥了作用，二者异常表达越明显，越能促进癌细胞增殖，导致肿瘤进展，增加颅外转移的发生。本研究结果显示，GATA4阳性是预后危险因素，而miR-195高表达是预后的保护因素。GATA4高表达能抑制miR15b表达，加速肿瘤细胞的分化、增殖，提高肿瘤侵袭性；GATA4过表达的患者肿瘤细胞增殖能力增强，GATA4可能将miR15家族转录激活，调节下游靶基因信号传导，从而下调抑癌基因表达，导致机体促癌细胞凋亡作用减低，促进肿瘤发生、进展[17]。miR195能调节细胞周期蛋白D1、E水平，促进肿瘤细胞凋亡，而当其呈低表达时，促癌细胞凋亡作用削弱或丧失，导致癌细胞增殖，当miR-195表达增高时，能抑制癌细胞活性[18]。胥琳琳等[19]研究提示，miR-195在宫颈癌中呈低表达，且对宫颈癌预后有一定评估价值。因此，临床可考虑将调节GATA4、miR-195表达作为治疗恶性脑膜瘤的一种新型靶向指标，为该病治疗提供新方向。本研究还存在一定局限性，未能发掘GATA4对基因进行调控的结合位点，且对于GATA4的研究处于初步探索阶段，还需进一步深入探讨。

综上所述，恶性脑膜瘤组织中转录因子GATA4以阳性表达为主，miR-195表达则明显下调，WHO病理Ⅲ级、颅外转移、GATA4阳性是患者预后的危险因素，miR-195高表达是患者预后的保护性因素。