血清外泌体微小RNA-146a、微小RNA-92a对重症社区获得性肺炎患者发生急性呼吸窘迫综合征评估价值研究

高 税， 刘 平， 陈建锋， 余纪会

1.重庆市长寿区人民医院 呼吸与危重症医学科，重庆 401220；2.重庆医科大学附属第一医院 健康管理中心，重庆 400016

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratry distress syndrme，ARDS)是一种严重威胁生命的复杂、异质性综合征[1]。重症社区获得性肺炎(severe community-acquired pneumonia，sCAP)是ARDS较常见病因。由于ARDS患者病因不同或病理复杂性，因此，对治疗干预的反应也存在较大差异。在肺疾病和感染的发病机制中，微小RNAs(microRNAs，miRNAs)在基因表达转录后的调控中起重要作用。循环外泌体是由多种血液或内皮细胞脱落的双层膜囊泡，含有大量miRNAs，是细胞间通讯和微环境的重要介质。miRNA在循环外泌体中可稳定存在，且具有较大潜力成为可靠的诊断生物标志分子[2]。有研究表明，血清miR-146a、miR-92a可通过信号通路参与机体免疫，与sCAP患者的院内死亡有关[3]；然而，这些外泌体miRNAs用于早期预测某些疾病结局的生物学意义尚处于探索阶段。因此，本研究旨在探讨血清外泌体miR-146a、miR-92a sCAP患者发生ARDS的评估价值。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取自2019年1月至12月重庆市长寿区人民医院收治的72例sCAP患者为研究对象，其中，合并ARDS患者35例(合并ARDS组)，未合并ARDS患者37例(sCAP组)。合并ARDS组：男性26例，女性9例；年龄范围39～86岁。sCAP组：男性30例，女性7例；年龄范围41～89岁。纳入标准：年龄≥18岁；胸部X线检查出现肺部浸润，且至少出现以下一种体征和症状：咳嗽、咳痰、呼吸困难、腋下体温>38.0℃、听诊阳性；符合《社区获得性肺炎诊断和治疗指南(2016)》[4]社区获得性肺炎的诊断标准；根据肺炎严重指数(pneumonia severity index，PSI)评估其肺炎严重程度，所有患者均属于CAP Ⅳ～Ⅴ级(PSI>90分)。排除标准：入院时，患有严重全身性或呼吸系统疾病者(包括肺结核、哮喘、慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化、泌尿道感染)；晚期疾病者(任何类型的恶性肿瘤、终末期肝病或肾病)；严重免疫抑制和拒绝知情同意者。住院期间，根据柏林定义[5]诊断ARDS的发生；并且按照患者入院28 d内的存活情况，将合并ARDS组患者进一步分为存活亚组(n=23)与死亡亚组(n=12)。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均在入院后24 h内签署书面知情同意书。

1.2 研究方法 收集两组患者的临床资料，包括基线临床变量、实验室数据、急性生理和慢性健康状况评分Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluationⅡ，APACHEⅡ)、序贯器官衰竭估计评分(sequential organ failure assessment，SOFA)、住院时间、住院期间的并发症、机械通气参数、治疗情况等。同时对患者28 d病死率进行随访以评估预后。在入住ICU 24 h内，采集患者静脉血样，4℃下3 500 r/min离心15 min，制备血清样本，将样本一式两份，一部分保存在-80℃，用酶联免疫吸附测定试剂盒检测(解冻后的)血清中白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-10水平。另外取0.5 ml血清样本在4℃下3 500 r/min离心15 min，然后在12 000 r/min下第二次离心10 min，以去除残留的细胞碎片，用全血清外泌体分离试剂盒(美国Invitrogen公司)分离纯化血清外泌体，并重悬于磷酸盐缓冲液中，-80℃保存。为了防止外泌体降解和丢失，在采血后30 min内处理样本。取外泌体固定在formvar涂层的铜-钯网格上，用3%磷钨酸染色，烘干后通过HT7700 Exalens透射电子显微镜(日本Hitachi公司)检查了外泌体的大小和形态特征。并用NanoSight纳米粒子追踪分析仪追踪外泌体颗粒粒径分布和相对浓度，采用免疫印迹法检测外泌体样本中CD9、CD63表达情况。用ExoQuick®外泌体提取和RNA纯化试剂盒(美国Invitrogen公司)提取外泌体总RNA。采用Bulge-loopTMmirna qRT-PCR起始试剂盒(广州锐博)进行反向转录和定量。加入cel-miR-39-3p被用作内部标准化控制。PCR的热循环条件为：95℃初始变性20 s，随后进行40个循环(95℃变性10 s，60℃退火20 s，70℃延伸10 s)，熔融曲线阶段确认引物的特异性。平行进行3次，将每个miRNA的循环阈值(Ct)标准化为cel-miR-39-3p，用2-ΔΔCt法分析miR-92a、miR-146a的相对表达水平。

2 结果

2.1 两组患者的一般资料比较 两组患者年龄、性别、体质量指数、吸烟史、SOFA分数、PSI、共病、并发症等比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；合并ARDS组患者APACHEⅡ分数以及血清CRP、PCT、IL-6、IL-10水平高于sCAP组，住院时间也长于sCAP组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组患者的一般资料比较/例(百分率/%)

2.2 血清外泌体获取及鉴定 用超速离心法从sCAP患者血清中提取并纯化得到双层膜结构的球型或椭球型的囊泡，用透射电镜观察，颗粒分布均匀，粒径大小约为50～150 nm。根据纳米粒径追踪技术，显示外泌体粒径主要分布在75～117 nm。同时，经Western blot法检测，这些颗粒高表达CD9、CD63，显示外泌体的主要特征，证实从血清样本中成功分离得到外泌体样本。见图1。

图1 从血清样本中分离的外泌体的特性(a.透射电镜观察;b.纳米粒径追踪分析;c.免疫印迹法检测外泌体标志物)

2.3 两组患者血清外泌体miR-146a、miR-92a水平比较 合并ARDS组患者miR-146a、miR-92a水平均明显高于sCAP组，两组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组患者血清外泌体miR-146a、miR-92a水平比较

2.4 ROC曲线分析血清外泌体miR-146a、miR-92a预测sCAP患者发生ARDS的临床价值 血清外泌体miR-146a、miR-92a水平预测sCAP患者发生ARDS的ROC曲线下面积(area under curve，AUC)分别为0.817(95%可信区间0.717～0.918)、0.801(95%可信区间0.688～0.913)，均超过血清CRP、PCT及APACHE Ⅱ评分预测ARDS的AUC。见表3、图2。

表3 血清外泌体miR-146a、miR-92a水平预测sCAP患者发生ARDS的价值

图2 miR-146a、miR-92a预测sCAP患者发生ARDS的ROC曲线

2.5 ARDS组患者血清外泌体miR-146a、miR-92a水平 入院28 d，死亡亚组患者miR-146a、miR-92a水平均高于与存活亚组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 死亡亚组和存活亚组ARDS组患者血清外泌体miR-146a、miR-92a水平比较

2.6 血清外泌体miR-146a、miR-92a预测ARDS患者28 d死亡的临床价值 血清外泌体miR-146a、miR-92a水平预测ARDS患者28 d死亡的AUC分别为0.832(95%可信区间0.680～0.984)、0.859(95%可信区间0.734～0.983)。miR-92a预测ARDS患者28 d死亡的效能较高，其AUC均超过血清CRP、PCT、IL-6、IL-10及APACHE Ⅱ评分。见表5、图3。

表5 血清外泌体miR-146a、miR-92a水平预测ARDS患者28 d死亡的价值

图3 miR-146a、miR-92a预测ARDS患者28 d死亡的ROC曲线

3 讨论

目前，ARDS的病死率为25%～40%[6]。sCAP是发生ARDS的重要原因[7]。近年来，外泌体作为miRNA载体，为新型生物标志物的发现提供了更多启示。本研究发现，合并ARDS组患者血清外泌体miR-146a、miR-92a水平显著高于sCAP组，差异均有统计学意义(P<0.05)。有研究显示，支气管上皮细胞来源的外泌体可调节炎症和纤维化过程，是维持肺内稳态的主要因素[8]。Ismail等[9]的研究亦证明，肺泡巨噬细胞衍生的外泌体能通过转移miRNAs到各种呼吸细胞，包括肺上皮细胞和单核细胞，以调节气道炎症，从而在气道生物学和上皮重建中发挥重要作用。因此，血清外泌体miR-146a、miR-92a为检测和监测sCAP患者发生ARDS提供可能性。ARDS是一种病死率较高的呼吸系统疾病，以肺泡组织通透性增加、纤维蛋白沉积为主要特征。有研究表明，巨噬细胞是ARDS发病机制中的关键因素[10]。Lee等[11]的研究发现，小鼠吸入酸性物质会引起上皮细胞衍生的外泌体囊泡的大量释放，且这些外泌体中富含大量miRNAs，可在血清中检测到。使用外泌体miRNA作为ARDS生物标志物具有潜在的优势，首先，上皮源性或巨噬细胞源性外泌体包含的miRNAs可影响ARDS/急性肺损伤的疾病进程；其次，外泌体的脂质双层膜可保护miRNA免受降解，并保证其更好的长期保存稳定性；第三，外泌体降低了生物流体的复杂性，有助于更具体、更灵敏地检测低丰度分子[12]。miR-146a可通过靶向白细胞介素1受体相关激酶1和TNF受体相关因子6来调节Toll样受体和细胞因子，参与动脉粥样硬化的炎症过程[13]。此外，miR-146a的异位表达可能影响原代人成纤维细胞中IL-6的分泌。有研究表明，重度脓毒症和脓毒症诱发的急性肺损伤患者miRNA-146a水平显著升高，且可能是预测脓毒症诱发急性肺损伤病死率和疗效的生物标志物[14]。此外，血清高水平miR-92a表达亦与ARDS炎症进展有关，可作为急性肺损伤/ARDS的潜在生物标志[16]。余岳芬等[17]的研究发现，ARDS患者病情越严重，miR-92a、miR-146a表达水平越高，miR-92a、miR-146a表达水平是ARDS患者死亡的独立危险因素，这与本研究中外泌体miR-92a、miR146a的表达升高相似。本研究中，合并ARDS组患者血清外泌体miR-146a、miR-92a表达水平明显高于sCAP组，提示血清miR-92a、miR-146a 表达水平可能参与了ARDS的疾病进展。经ROC曲线分析，血清外泌体miR-146a、miR-92a水平对sCAP患者ARDS发生风险有一定的预测价值，灵敏度和特异度较高，且与其他指标相比较，血清外泌体miR-92a、miR-146a 预测sCAP患者发生ARDS的AUC相对较优，提示血清外泌体miR-92a、miR-146a预测sCAP患者发生ARDS具有更高的临床应用价值。另外，死亡亚组患者血清miR-92a、miR146a水平亦高于存活亚组，且检测血清外泌体miR-92a、miR-146a对于预测sCAP合并ARDS患者28 d死亡也具有一定的临床效能，AUC>0.700，说明血清外泌体miR-92a、miR-146a是预测sCAP合并ARDS患者28 d死亡的较佳指标，具有较高的应用价值。

综上所述，血清外泌体miR-92a、miR-146a水平对预测sCAP患者ARDS发生风险有一定的临床价值。但本研究仍处于初步探索阶段，仍需要更多的临床研究来进一步证实。