基于网络药理学预测小檗碱治疗心房颤动作用靶点及通路

王 洋， 张 建， 辛芳冉 ， 兰 怀， 王辉山

1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847；2.北部战区总医院 心血管外科，辽宁 沈阳 110016

心房颤动的发病率和病死率均较高，且与脑卒中和其他栓塞性疾病相关[1-3]。小檗碱是一种异喹啉生物碱，是中药黄连的主要活性成分。有研究表明，小檗碱具有抗心律失常、抗血小板聚集、保护心肌细胞、抗充血性心力衰竭及减轻缺血再灌注损伤等多种药理作用[4]。

网络药理学(network pharmacology，NP)是一门应用生物学和多向药理学理论来分析生物系统网络并选取特定信号节点，进行多靶点药物分子设计的新学科[5-6]。NP可通过推断小分子与基因、蛋白质、代谢物等靶点和网络的相关性，进而构建“药物-靶点-疾病”相互作用网络，全面系统地探索药物治疗疾病的作用机制。由于中药具有多成分、多靶点、系统调节的特点，其被广泛认为是一种从综合角度识别中药成分和药理机制的补充方法[7]。本研究基于NP手段，构建小檗碱与心房颤动相互作用的药物与生物分子复杂关系网络，发掘药物作用靶点及药物与内源性蛋白及生物通路的作用关系，科学推断小檗碱的作用靶点，探究其治疗心房颤动的分子作用机制，为基础研究和临床应用提供新思路和科学依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 小檗碱靶点筛选 小檗碱的化学结构通过有机小分子生物活性数据库Pubchem(https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库检索关键词“berberine”获取，将其保存为Smiles格式。将得到的小檗碱Smiles结构导入Swiss Target Prediction(http://www.swisstarget-prediction.ch/)数据库，并限定研究物种为人类(Homo sapiens)，由此获得与小檗碱较相关的靶点信息。利用GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索关键词“berberine”，获取小檗碱相关靶点。最后将3个数据库所获得的靶点合并删除重复项，筛选出小檗碱的潜在作用靶点。

1.2 心房颤动靶点筛选 利用DisGeNET数据库[8](http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu)、OMIM 数据库[9](http://www.omim.org/)和 TTD数据库[10](http://db.idrblab.net/ttd/)搜索疾病关键词为心房颤动，合并3个数据库结果，去除重复和假阳性结果，获得心房颤动相关的疾病靶点。

1.3 小檗碱-心房颤动靶点互作网络构建 为明确小檗碱潜在作用靶点与心房颤动相关疾病靶点之间的相互作用关系，将筛选出的小檗碱靶点与心房颤动靶点进行交集，并应用Venny软件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)绘制韦恩图，筛选出小檗碱-心房颤动共同作用靶点。将筛选得到的共同作用靶点在String数据库平台(https://string-db.org/)构建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络模型，将蛋白种类设置为“Homo sapiens”，“highest confidence”参数设为>0.9，其他参数不变，获得PPI网络。String数据库是一个搜寻蛋白质之间相互作用的数据库，既包括蛋白质之间直接物理相互作用，亦包括蛋白质之间的间接功能相关性。

1.4 小檗碱-心房颤动靶点的生物功能注释及KEGG通路分析 为进一步了解上述筛选出共同靶点基因的生物功能以及其在KEGG信号通路中的作用。利用Cytoscape软件的Clue GO插件对共同作用靶点进行GO-生物学过程(biological process，BP)的生物功能富集，分析小檗碱治疗心房颤动作用靶点的BP，并将共同作用靶点基因输入DAVID平台(https://david.ncifcrf.gov/)，选择通路分析中KEGG信号通路，显著性设定为P<0.05，进一步寻找小檗碱治疗心房颤动的KEGG信号通路，并利用Cytoscape软件绘制小檗碱-心房颤动共有靶点-GO-BP生物功能-KEGG信号通路网络。

2 结果

2.1 小檗碱、心房颤动共同作用靶点 通过在Pubchem数据库检索小檗碱，得到其结构式，并保存Smiles格式。见图1。通过将小檗碱的Smiles格式上传到Swiss Target Prediction数据库，由此获得与小檗碱较相关的靶点信息。利用GeneCards数据库、TCMSP数据库检索关键词“berberine”获取小檗碱相关靶点。合并3个数据库结果、删除重复项，共筛选出小檗碱的作用靶点339个。通过DisGeNET数据库、OMIM数据库与TTD数据库对心房颤动疾病靶点进行搜索、筛选，共获得心房颤动相关疾病靶点398个。将339个小檗碱靶点与398个心房颤动靶点输入Venny 2.1软件绘制韦恩图，两者取交集后获得小檗碱-心房颤动共同作用靶点50个。见图2。

图1 小檗碱结构式 图2 小檗碱-心房颤动共同作用靶点韦恩图

2.2 小檗碱-心房颤动PPI网络构建 将上述50个小檗碱-心房颤动共有作用靶点导入String数据库，得到PPI相互作用关系。其中，有50个节点，396条边。每个节点代表一个蛋白质，每条边代表两个蛋白质之间的关系，线条越多则表示其关联度越大，即度值越大。见图3～4。通过分析发现，小檗碱-心房颤动共有靶点中，白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、内皮型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase 3，NOS3)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP9)、信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)等较重要。

图3 小檗碱—心房颤动共有靶点PPI网络 图4 小檗碱-房颤共有靶点的度值

2.3 GO功能富集分析 在DAVID数据库中，对筛选出的50个小檗碱-心房颤动共同作用靶点进行GO功能富集分析得到GO条目1 644个(P<0.05)，其中，BP条目1 544个，细胞组成(cellular component，CC)条目31个，分子功能(molecular function，MF)条目69个。多个生物学功能与心房颤动的发生、发展关系密切。其中，与心房颤动有关的生物功能主要富集于脂多糖的响应、活性氧代谢过程、第二信使介导的信号传递、蛋白激酶活性的激活、细胞对氧化应激的反应、细胞外基质的组织、细胞外调节蛋白激酶级联、急性炎症反应、转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)的响应、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)活性的激活、Janus激酶-信号转导子和转录激活子(Janus kinase-signal transducers and activators of transcription，JAK-STAT)级联等。见图5～7。

2.4 KEGG信号通路分析 将50个小檗碱-心房颤动共有靶点输入DAVID平台进行KEGG通路富集分析，筛选得到128条信号通路(P<0.05)。其中，与心房颤动直接相关的有30个。小檗碱作用靶点可能与肿瘤坏死因子信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、G磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B， PI3K/Akt)信号通路、MAPK信号通路、白细胞介素17(interleukin 17，IL-17)信号通路、Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)信号通路、缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)信号通路、VEGF信号通路、肥厚型心肌病信号通路、TGF-β信号通路等密切相关。见图8。综合分析GO和KEGG通路富集分析结果，筛选出可能具有治疗心房颤动作用的通路，并将其与小檗碱和心房颤动共同的潜在靶点一一对应，利用Cytoscape软件构建出小檗碱治疗心房颤动的“靶点—GO-BP—KEGG”网络。见图9。

3 讨论

目前，西医治疗心房颤动多采用控制心室率、恢复并维持窦性心律以及抗凝药物或采用射频消融、外科手术和起搏治疗等非药物疗法[11]。传统药物疗法有明显的不良反应，非药物疗法其费用相对较高。因此，上述治疗方法在安全性、有效性方面均受制约。随着中药学理论的不断完善和发展，小檗碱作为中药黄连的主要成分，具有治疗心血管疾病特别是抗心律失常的作用，越来越广泛用于临床和基础研究[12]。

本研究通过网络药理的方法，发现小檗碱与心房颤动共有50个靶点，这些靶点是二者作用的关键分子基础，并在关系网络中体现了较好的连通特性。通过对共同作用靶点的PPI网络分析发现，IL-6、TNF、VEGF、NOS3、MMP9、STAT3等靶点在网络中具有重要作用。在GO富集分析中,靶点与脂多糖的响应、活性氧代谢过程、第二信使介导的信号传递、蛋白激酶活性的激活、细胞对氧化应激的反应、细胞外基质的组织、ERK1和ERK2级联、急性炎症反应、转化生长因子β的响应、MAPK活性的激活、JAK-STAT级联等密切相关。此分析过程中，多个靶点具有相似的BP，并存在多靶点协同作用的特性。这提示，小檗碱治疗心房颤动可能通过上述BP发挥作用。在KEGG信号通路分析中，发现小檗碱可能主要通过TNF信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、PI3K-Akt、MAPK、IL-17、TLR、HIF-1、VEGF、TGF-β等信号通路作用治疗心房颤动。通过对上述靶点和通路分析发现，小檗碱治疗心房颤动的靶点与多种BP及信号通路密切相关。其作用机制主要涉及炎症反应、氧化应激、心房纤维化及血管生成等。有研究表明，炎症标志物IL-6和TNF在心房颤动的发生、发展中起重要作用[13]。IL-6大量形成可激活机体的炎症反应与氧化应激，导致心肌增生和纤维化的形成，且可通过激活JAK/STAT信号通路实现其生物学功能[14]。TNF是一种重要的内生性炎症调节因子,在炎症反应和免疫反应中发挥重要作用。TNF亦可通过影响心肌细胞离子通道和缝隙连接等生物学功能，使心房发生电重构，引发心房颤动[15]。心房颤动患者的IL-6和TNF表达增高，说明可以通过抑制炎症以预防其发病[16-17]。活性氧(reactive oxygen species，ROS)是诱发氧化应激的直接引物[18]。ROS水平增加可促进成纤维细胞过度增殖、迁移，激活STAT3和SMAD3信号转导，促进心房肌纤维化，导致心房结构重构，而心房结构重构被认为是心房颤动持续的主要机制[19]。Goette等[20]研究发现，慢性心房颤动患者心房肌纤维化明显，与窦性心律者比较，MAPK信号通路的信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)和蛋白质表达增加，因此，认为MAPK通路可导致心房肌结构重构，发生心房颤动。包括HIF-1信号通路和TNF信号通路在内的氧化应激和炎症反应的增强，在心房颤动发作中起重要作用，切断该作用可望成为阻止心房颤动发生的新方法[21]。有研究表明，小檗碱具有抗氧化、抗炎、抗增殖和清除自由基活性的作用[22]。小檗碱可抑制脂多糖诱导的NOS3、IL-6、ROS等炎症及氧化基因的表达[23]。McCubrey等[24]研究发现，小檗碱可以抑制ROS的生成，防止氧化应激的发生。小檗碱可激活PI3K/AKT通路，在有侵袭性因子存在时，可限制促炎过程和凋亡事件[25]。陈博等[26]研究发现，小檗碱可通过下调TLR4的mRNA和蛋白表达，进而抑制氧化应激和炎症反应。刘岩等[27]研究发现，小檗碱可抑制JAK/STAT信号通路中STAT3磷酸化的表达。

图5 GO功能富集分析BP 图6 GO功能富集分析CC

图7 GO功能富集分析MF 图8 KEGG功能富集分析结果

图9 小檗碱-心房颤动共有靶点-GO-BP-KEGG信号通路网络图

综上所述，本研究整体性预测了小檗碱的功效物质基础和对心房颤动的分子机制，并挖掘了较多潜在的治疗靶点，说明小檗碱治疗心房颤动具有多靶点-多通路的作用特点。