雷帕霉素在脓毒症致肺纤维化大鼠中应用研究

陈 硕， 邵美琪， 陈 达

中国医科大学附属第四医院1.急诊科；2.全科医学科，辽宁 沈阳 110032

革兰阴性杆菌是各类重症感染常见的致病菌，其内毒素成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰阴性杆菌感染所致脓毒症发病的重要启动因子，亦是脓毒症相关性急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)和肺纤维化发生的重要因素。脓毒症肺损伤的病理演变主要分为两个阶段：(1)急性渗出期，早期发生，主要表现为肺微血管通透性增高、肺泡渗出液增多；(2)纤维化增殖期，肺损伤1周后即可出现，可持续数周乃至数月，主要表现为肺成纤维细胞逐渐增多，其分泌的胶原等细胞外基质成分沉积于肺间质，最终形成肺间质弥漫性纤维化[1]。羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)是机体胶原蛋白成分的一种，其含量能够反映组织中胶原的代谢情况，测定肺组织中HYP的含量能够反映胶原的沉积情况，从而反应肺组织纤维化程度。肺成纤维细胞是直接合成和分泌胶原蛋白的效应细胞，其在各种致纤维化因素作用下发生异常增殖活化并分泌胶原蛋白，是肺间质和肺泡内胶原蛋白沉积及肺纤维化发生的关键机制。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是一种有效地促进纤维细胞增殖的生长因子，其主要作用是诱导成纤维细胞的增殖和分化，促进胶原蛋白的转录与合成，抑制基质降解酶等多种蛋白水解酶的合成[2]。α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)在肺纤维化过程中亦起到关键作用，其主要受TGF-β1的刺激而表达[3]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是一类降解酶系，主要通过降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的多种蛋白成分来参与肺纤维化的发病[4]。MMPs组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs)是MMPs系统的特异性抑制因子，对MMPs的功能调节起重要作用。雷帕霉素因其具有免疫抑制作用及减轻炎症损伤及抑制细胞增殖等特点，近年来备受关注。本研究通过向大鼠腹腔注射LPS建立脓毒症肺损伤模型，给予雷帕霉素作为干预措施，观察脓毒症后期不同时间点肺组织TGF-β1、α-SMA、MMP-2及TIMP-1的表达的变化，旨在探讨雷帕霉素对脓毒症肺纤维化的保护作用及机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 雷帕霉素试剂盒(雅培制药有限公司)；LPS(美国Sigma公司)；HYP测试盒 、TGF-β1 抗体、α-SMA 抗体(上海晶抗生物工程)。清洁级SD大鼠，雌雄各半，体质量240～260 g，由中国医科大学实验动物科学部提供。

1.2 分组与建模 将90只SD大鼠根据随机数字表法分为对照组、脓毒症组与雷帕霉素组，每组各30只。根据实验时间(第7、14、21、28、35天)分别将对照组、脓毒症组和雷帕霉素组大鼠分为5个亚组，每个亚组6只。对照组大鼠给予生理盐水2 ml腹腔注射；脓毒症组大鼠给予LPS 5 mg/kg+2 ml生理盐水腹腔注射；雷帕霉素组大鼠给予LPS 5 mg/kg+2 ml生理盐水腹腔注射，1 h后给予雷帕霉素2 mg/kg+2 ml生理盐水腹腔注射。

1.3 肺标本采集及相应处理 在实验第7、14、21、28、35天，各组大鼠分别采用5%水合氯醛5 ml/kg进行腹腔注射麻醉，麻醉后快速颈动脉急性放血处死，剪下肺叶。左肺用甲醛固定，石蜡包埋、切片，HE、Masson染色处理。右肺于生理盐水清洗干净后，于-80℃冰箱冻存，用于HYP含量、免疫印迹检测肺组织TGF-β1及α-SMA的表达及实时荧光定量聚合酶链式反应检测肺组织MMP-2及TIMP-1的mRNA表达。

1.4 Ashcrof评分 Ashcrof评分[5]将肺纤维化程度分成10级，每只大鼠随机选取3张肺组织HE染色切片样本，每个样本30个观测点在光镜下对肺组织切片进行纤维化程度半定量分析，通过求得90个观测点平均数作为该样本的肺纤维化程度评分，每张切片均邀请2名专家采用双盲法进行评分。

1.5 肺组织匀浆HYP含量测定 取右肺组织反复碾碎，充分混合，置于磨口试管中，用6 mol/L HCl水解(125℃)，3 h后，稀释至10 ml，过滤。取滤液加蒸馏水后充分混合，加入柠檬酸缓冲液和氯胺T溶液氧化6 min后，过氯酸终止反应。静置5 min，加入100 g/L对二氨基苯甲醛(para-diaminobenzaidehyde，PDAB)于80℃水浴中保温10 min，完全显色后，自来水(25℃)冷却5 min。采用7210分光光度计在560 nm波长比色，测量其吸光度值，计算肺组织HYP含量。

1.6 免疫印迹法检测大鼠肺组织α-SMA、TGF-β1蛋白表达 配制溶液(组织裂解试剂、RIPA裂解液、电泳缓冲液、电泳转印缓冲液、样品缓冲液)，提取总蛋白十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)转膜，检测光密度值，目的条带与相应的内参光密度值之比为该蛋白的相对表达量。

1.7 实时荧光定量聚合酶链式反应检测大鼠肺组织的MMP-2、TIMP-1的mRNA表达 取大鼠肺组织30 mg，充分研磨后加入1 ml Trizol，摇匀后于室温静置10 min，加入0.2倍体积的氯仿，12 000×g离心15 min，取上层液并加入0.5倍体积的异丙醇，混匀后室温下静置10 min。接着12 000×g离心10 min，弃上层悬液后取沉淀加入1 ml 75%乙醇洗涤，混匀后7 500×g离心10 min，弃上清液。在空气中干燥沉淀后，加入适量无RNase水，使RNA完全溶解。测定RNA纯度及浓度，琼脂糖电泳检测RNA完整性。37℃孵育30 min。加入25 mM的EDTA 1 μl，65℃温育10 min，使酶失活。反转录(20 μl体系)，实时荧光定量聚合酶链式反应(25 μl体系)，实时荧光定量聚合酶链式反应扩增程序，循环结束后进行融点曲线分析，于60℃～95℃进行测定，条件设置升温幅度每次0.5℃，1次5 s。用2-△△Ct法分析基因表达变化，与内参照比较后分析数据。参照基因库基因序列自行设计MMP-2、TIMP-1及GAPDH引物，并由上海生工生物工程有限公司合成。见表1。

表1 引物序列和产物长度

2 结果

2.1 大鼠肺组织病理改变 HE染色结果显示，对照组肺泡结构清晰，无炎性细胞浸润。实验7 d，脓毒症组出现明显肺泡炎性改变，伴有血管内皮细胞损伤，肺泡腔塌陷；实验14 d，炎性改变减轻，成纤维细胞增生，肺间隔增宽；实验35 d，病变范围弥散，大量肺泡结构萎陷、破坏，肺泡间隔明显增宽，组织增生明显。经雷帕霉素治疗后，肺内病变较脓毒症组减轻，实验7 d，雷帕霉素组炎症反应减轻；实验14、35 d，肺间隔增宽、组织增生明显减轻。见图1。Masson染色结果显示，对照组支气管周围及肺泡间隔区有少量胶原纤维。实验7 d，脓毒症组肺泡壁增厚，支气管周围及肺泡间隔的胶原纤维较纤细，部分肺泡结构破坏；实验14 d，病变范围弥散，支气管周围、肺泡间隔进一步纤维性增厚，成纤维细胞增生明显；实验35 d，支气管周围、肺泡间隔及肺泡内有大量粗大胶原纤维束不规则排列。经雷帕霉素治疗后，肺内病变较脓毒症组减轻，实验7 d，雷帕霉素组未见明显胶原纤维增生；实验14、35 d，胶原纤维明显少于脓毒症组。见图2。

2.2 Ashcrof评分判定肺组织纤维化 脓毒症组、雷帕霉素组大鼠肺组织Ashcrof评分在实验第7天开始升高，第21天达到高峰，之后下降，且实验第7、14、21、28、35天，与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。实验第7、14、21、28、35天，雷帕霉素组大鼠肺组织Ashcrof评分均低于脓毒症组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

图1 各组大鼠不同时间肺组织HE染色变化情况(a.对照组7 d；b.对照组14 d；c.脓毒症组7 d；d.脓毒症组14 d；e.脓毒症组35 d；f.雷帕霉素组7 d；g.雷帕霉素组14 d；h.雷帕霉素组35 d；HE×200)

图2 各组大鼠不同时间肺组织Masson染色变化情况(a.对照组7 d；b.对照组14 d；c.脓毒症组7 d；d.脓毒症组14 d；e.脓毒症组35 d；f.雷帕霉素组7 d；g.雷帕霉素组14 d；h.雷帕霉素组35 d；Masson×200)

表2 3组大鼠Ashcrof评分变化评分/分)

2.3 3组大鼠肺组织HYP含量变化 脓毒症组、雷帕霉素组大鼠肺组织HYP含量在实验第7天开始升高，第21天达到高峰，之后下降，且实验第7、14、21、28、35天，与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。实验第7、14、21、28、35天，雷帕霉素组大鼠肺组织HYP含量均低于脓毒症组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.4 免疫印迹法检测大鼠肺组织TGF-β1、α-SMA表达变化 脓毒症组、雷帕霉素组大鼠肺组织α-SMA、TGF-β1表达在实验第7天开始升高，第21天达到高峰，之后下降，且实验第7、14、21、28、35天，与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。实验第7、14、21、28、35天，雷帕霉素组大鼠肺组织α-SMA、TGF-β1表达均低于脓毒症组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3。

2.5 实时荧光定量聚合酶链式反应检测大鼠肺组织MMP-2、TIMP-1的mRNA表达变化 脓毒症组、雷帕霉素组大鼠肺组织MMP-2的mRNA表达在实验第7天开始升高，第21天达到高峰，之后下降，且实验第7、14、21、28、35天，与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。脓毒症组、雷帕霉素组大鼠肺组织TIMP-1的mRNA表达在实验第7天开始升高，第28天达到高峰，之后下降，且实验第7、14、21、28、35天，与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。实验第7、14、21、28、35天，雷帕霉素组大鼠肺组织MMP-2、TIMP-1的mRNA表达均低于脓毒症组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4～5。MMP-2、TIMP-1熔点曲线仅显示1个峰值，未出现杂峰，提示无非特异性荧光信号，目的基因扩增产物单一。见图4～5。

图3 3组大鼠不同实验时间肺组织α-SMA、TGF-β1蛋白表达变化(a.α-SMA蛋白表达变化；b.TGF-β1蛋白表达变化)

表4 3组大鼠肺组织MMP-2的mRNA表达变化

表5 3组大鼠肺组织TIMP-1的mRNA表达变化

图4 MMP-2熔点曲线及数据 图5 TIMP-1熔点曲线及数据

3 讨论

LPS诱导的急性肺损伤迅速发展为ARDS及肺纤维化，预后差、病死率高，其中，内毒素是LPS致病的主要毒性物质[6]。但目前对内毒素诱导肺纤维化的机制尚未明确，亦无有效治疗药物。雷帕霉素是一种新的大环内酯类免疫抑制剂，在器官移植、肿瘤患者、涂层支架及实验性肝、肾纤维治疗中已取得显著疗效[7]。肺纤维化的发生是肺泡过度损伤，上皮细胞过度破坏、凋亡及肺组织重构的一个动态演变过程，同时，细胞因子级联反应和多种酶蛋白功能失衡亦发挥重要作用[8]。其中，较常见的一类细胞生长因子是TGF-β1。有研究显示，TGF-β1能促进成纤维细胞合成胶原蛋白、纤维连结蛋白、蛋白多糖等细胞外基质，促进细胞外基质的沉积，在肺纤维化过程中起重要作用[9]。本研究通过HE、Masson染色发现，对照组大鼠肺泡及其周围细胞结构完整，无炎性细胞渗出；雷帕霉素组大鼠肺泡实验第7天出现明显炎性改变，实验第14天出现肺泡结构破坏，伴有大量以中性粒细胞为主的炎性细胞渗出，实验第35天肺泡结构消失，肺泡萎陷，肺组织结构重塑明显，经雷帕霉素治疗后，大鼠肺内病变较明显减轻。在实验第7、14、21、28、35天，脓毒症组、雷帕霉素组大鼠肺组织HYP的含量、Ashcrof评分均较对照组明显升高，经雷帕霉素治疗后，HYP含量、Ashcrof评分均降低。这说明，雷帕霉素可降低肺HYP含量，对肺纤维化有保护作用。雷帕霉素大鼠肺组织中TGF-β1表达明显降低，说明雷帕霉素可通过降低TGF-β1表达，影响肺纤维化的病情进展。在TGF-β1的作用下，肺成纤维细胞能向肌成纤维细胞转分化，被认为是肺纤维化时肺内肌成纤维细胞的重要来源之一，因此，其在肺纤维化过程中起重要作用[10]。肌成纤维细胞是一类α-SMA表达阳性的细胞，被认为同时具备成纤维细胞和平滑肌细胞的特性，且亦能分泌大量细胞外基质，在成纤维细胞的激活过程中，α-SMA可作为一种活化标记物[11]。本研究结果发现，经雷帕霉素治疗后，大鼠肺组织α-SMA表达明显降低。这说明，雷帕霉素可通过降低α-SMA表达，从而对脓毒症所引起肺纤维化过程起到一定保护作用。有研究表明，肺间质纤维化是由于ECM的过度沉积，这种过度沉积可能是ECM合成增多，更大程度上是ECM降解减少即合成和降解不平衡引起的[12]。其中，MMPs、TIMPs肺组织在ECM合成/降解的调节过程中起重要作用[13]。在正常机体内，MMPs可通过分解ECM来控制其数量，当炎性作用刺激ECM过度表达时，亦会引起MMPs、TIMPs的过度表达[14]。本研究应用LPS建立大鼠肺纤维化模型，通过实时定量聚合酶链式反应测定大鼠血清中MMP-2及TIMP-1的mRNA表达，脓毒症组大鼠肺组织中MMP-2、TIMP-1 mRNA的表达从实验第7天开始逐渐升高，但MMP-2、TIMP-1的mRNA表达到达高峰的时间不一致，从而得知，在肺纤维化发病机制中，二者分泌比例失衡。经雷帕霉素治疗后，大鼠肺组织中MMP-2、TIMP-1的mRNA表达均明显降低，肺纤维化过程减轻。

综上所述，雷帕霉素可能通过降低TGF-β1、α-SMA、MMP-2及TIMP-1的表达，减轻脓毒症致肺纤维化的进展程度，从而发挥对肺损伤的保护作用。