癫痫持续状态模型中海马神经元损伤情况和可能机制

时间：2024-11-11

孙桂好刘建民孙友禄陈正红郑利敏

262100 安丘市人民医院神经外科1，山东安丘

250000 山东中医药大学附属医院神经外科2，山东济南

257300 广饶县人民医院神经外科3，山东东营

276499 临沂市中心医院心电图室4，山东临沂

271000 泰安市中心医院神经外科5，山东泰安

癫痫持续状态被氯化锂-毛果芸香碱诱发后会引发几个脑区神经元的严重病变，其中最为显著的为海马区损伤[1]。本研究探讨癫痫持续状态模型中海马神经元损伤情况和可能机制，现报告如下。

资料与方法

购买山东大学实验动物中心提供的12 只健康雄性Wistar 大鼠，体重200～240 g，饲养温度23～25℃，让其自由饮食、进水。

方法：①试剂与仪器：购买美国Sigma-Aldrich公司生产的氯化锂，瑞士Roche 公司生产的In Situ Cell Death Detection Kit(POD)原位凋亡检测试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司生产的二氨基联苯胺(DAB)，上海博生物试剂公司生产的蛋白酶抑制剂混合物，美国Santa Cruz 公司生产的Normal rabbit IgG+Protein A/G plus agarose。②动物分组与大鼠模型制备：随机分为实验组、对照组，每组6只。实验组对癫痫发作进行诱导途径为给予Wistar 大鼠腹腔注射氯化锂127mg/kg，18～24h后给予其腹腔注射毛果芸香碱30mg/kg，注射毛果芸香碱前30 min给予大鼠腹腔注射硫酸安托品1 mg/kg，出现癫痫持续状态后1～1.5 h给予大鼠腹腔注射地西泮10 mg/kg将抽搐解除。依据Racine分级标准评价痫性发作行为学，正常行为状态评定为0级；面部肌肉在立须、眨眼、咀嚼等情况下抽搐，颤动呈“湿狗样”评定为1级；颈部肌肉抽搐，主要表现为点头运动评定为2级；前肢抽搐、阵挛评定为3级；双侧前肢伸直伴身体立起评定为4级；跌倒并全身惊厥评定为5级[2]。复杂部分发作：1级+2级+3级；全身强直阵挛发作：4级+5级，指成功诱发。对照组：给予Wistar大鼠腹腔注射等剂量氯化锂+生理盐水。③灌注取材：分批处死两组大鼠，然后用水合氯醛100 mg/L对大鼠进行麻醉后进行心脏灌流、固定、脱水、透明、石蜡包埋，用石蜡切片机连续冠状切片，厚度为5 μm。对海马CA1、CA3区形态学变化、凋亡情况进行观察，途径为TUNEL染色、Nissl染色。

观察指标：①海马形态学变化。②海马神经元凋亡情况。③不同时间点Glu R2蛋白表达。

研究方法：①观察海马形态学变化。石蜡切片，常规脱蜡至水，孵育10 min，位置为在37℃水浴箱中，然后分化到背景无色，在此过程中分别将乙醇950 mL/L、硫堇5 mL/L充分利用起来，常规脱水、透明、封片。将1个切片从每隔5张中取出来，共将3张取出来Nissl 染色。在显微镜(×400)下对CA1、CA3 区100 μm×100 μm 区域神经元数量进行计数[3]。②海马神经元凋亡情况。TUNEL 染色，应用原位凋亡检测试剂盒，石蜡切片，常规脱蜡至水，将内源性过氧化物酶浸洗去除，在此过程中将过氧化氢(H2O2)30 mL/L充分利用起来。室温湿盒中对其进行通透，在此过程中将蛋白酶K 充分利用起来。在37℃的温度下对TUNEL 1 号、2 号混合液进行反应1 h，用PBS 代替1号液作为阴性对照组。PBS 清洗后将TUNEL 3 号液50 μL 加入，孵育30 min，位置为在37℃湿盒中。PBS清洗后将DAB加入显色，复染过程中将苏木精充分利用起来。常规脱水、透明、中性树胶封片。将邻近Nissl 染色的脑片利用起来，阳性细胞指有棕黄色颗粒出现在胞核中。光镜下对染色结果进行分析，每组将阳性细胞最明显的3 个×400 高倍视野从CA1、CA3区选取出来，将每个高倍视野下的阳性细胞数计算出来[4]。③不同时间点Glu R2 蛋白表达。Western blot 测定，冰上以较快的速度将海马取出来，用上海碧云天生物技术有限公司生产的RIPA 细胞组织快速裂解液将总蛋白提取出来，对蛋白浓度进行测定。每组用十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺对蛋白20 μg左右进行凝胶电泳，向聚偏二氟乙烯膜转入，TBST室温下封闭脱脂奶粉(50 g/L)70 min，将北京中杉金桥生物技术有限公司生产的1∶500 小鼠β-action 抗体、美国Chemicon 公司生产的1∶800 兔Glu R2 抗体加入，室温下孵育30 min，在4℃的温度下过夜，室温下孵育辣根过氧化物酶耦联第二抗体70 min。采用美国LI-COR 公司生产的C-DiGit 化学发光扫描仪显影，运用电化学发光法对灰度值进行测定。将内参设定为β-action，蛋白相对表达量=目的蛋白/内参蛋白灰度值[5]。④癫痫持续3 d 后Glu R2/GAPDH 耦合现象。免疫共沉淀、Western blot 技术检测，冰上以较快的速度将海马取出来，100∶1 混合蛋白酶抑制剂混合物和Western blot 及免疫沉淀细胞裂解液蛋白进行裂解，对蛋白浓度进行测定时运用BCA 法。采用Normal rabbit IgG+Protein A/G plus agarose 将非特异结合蛋白去除。在Normal rabbit IgG、兔Glu R2 抗体中分别加入蛋白500～600 μg，在4℃的温度下孵育过夜。在4℃的温度下孵育Protein A/G plus agarose 1 h，离心30 s，速率为10 000 r/min，将上清弃去。将1×SDS 上样缓冲液30 μL加入沉淀中，煮沸变性，进行Western blot步骤，比较实验组和对照组中GAPDH 和Glu R2 灰度值，将GAPDH/Glu R2的耦合变化获取过来[6]。

统计学分析：使用SPSS 20.0 统计学软件进行分析，计量资料用(±s)表示，比较采用F检验，重复测量的计量资料进行方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

两组大鼠的海马形态学变化比较：实验组大鼠持续6 h、1 d、3 d、7 d的海马CA1、CA3区神经元细胞数均低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，持续6 h、1 d、3 d的海马CA1、CA3区神经元细胞数均逐渐减少(P＜0.05)，但持续6 h和7 d的海马CA1、CA3区神经元细胞数之间的差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 两组大鼠的海马CA1、CA3区神经元细胞数比较(±s，个/HP)

组别 n 持续时间 CA1区 CA3区实验组 6 6 h 31.00±2.00 38.32±3.05 1 d 24.00±1.72 34.66±3.50 3 d 13.66±2.03 25.66±2.07 7 d 32.32±3.50 34.66±3.50对照组 6 44.32±5.12 52.32±4.50 F 4.541 4.303 P＜0.05 ＜0.05

两组大鼠的海马神经元凋亡情况比较：实验组大鼠持续6 h、1 d、3 d、7 d 的海马CA1、CA3 区凋亡细胞数均多于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，持续6 h、1 d、7 d、3 d 的海马CA1、CA3 区凋亡细胞数均逐渐增多(P＜0.05)，但持续1 d 和7 d 的海马CA1、CA3 区凋亡细胞数之间的差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 两组大鼠的海马CA1、CA3区凋亡细胞数比较(±s，个/HP)

组别 n 持续时间 CA1区 CA3区实验组 6 6 h 6.32±1.51 12.00±2.00 1 d 20.00±3.60 17.32±1.52 3 d 44.00±4.57 36.66±4.50 7 d 20.66±3.20 18.66±2.07对照组 6 2.00±0.06 5.66±1.52 F 6.965 3.365 P＜0.05 ＜0.05

两组大鼠的海马Glu R2 蛋白表达比较：实验组大鼠持续1 d、7 d 的海马Glu R2蛋白表达均多于持续3 d，差异有统计学意义(P＜0.05)，持续1 h、6 h的海马Glu R2蛋白表达和对照组之间的差异均无统计学意义(P＞0.05)，持续1 d、3 d、7 d的海马Glu R2蛋白表达均少于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图1。

图1 不同时间点Glu R2 蛋白表达

两组大鼠的癫痫持续3 d 后海马Glu R2/GAPDH耦合现象比较：实验组大鼠持续3 d 的海马Glu R2/GAPDH 蛋白复合物耦合程度高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图2。

图2 大鼠海马裂解液中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶