黄腐酸钠预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及其机制研究

宋健康 李铁成(通信作者)

124010 锦州医科大学盘锦辽油宝石花医院研究生培养基地1，辽宁盘锦

121000 锦州医科大学附属第三医院2，辽宁锦州

以急性心肌梗死为代表的缺血性心脏病严重危害着人们的生命健康，死亡率位居世界第一。目前以冠状动脉介入重新恢复血液灌注疗效最为显著，然而阻塞的血管血流再通后可能会引起原有缺血心肌组织损害进一步加重的现象，临床上称为心肌缺血再灌注损伤(MIRI)[1]。这种再灌注后所带来不可预估的心肌二次损害，给医疗工作人员带来很大困扰。黄腐酸钠具有较强的抗炎、抗氧化作用，并有活血化瘀、改善微循环的功效[2]。黄腐酸钠在I/R诱导的组织损伤中具有有益作用，特别是在肝、脑组织中，但是尚无研究证明黄腐酸钠对心脏是否同样会起到保护作用。本文中构建I/R大鼠心肌损伤模型，通过预处理的方式来探讨黄腐酸钠保护作用及机制，现报告如下。

材料与方法

试验动物：选取50 只健康的SD 大鼠，重量200～250 g，均为雄性，正常喂养；试验动物为锦州医科大学生物试验室提供。

主要试剂：黄腐酸钠，有效物质含量99%，批号：Z41020418，订购于山西省吕梁市盛大生物发展有限公司；其他试剂由锦州医科大学生命科学院试验室提供。

方法：①分组及给药：将50 只大鼠随机平均分为五组，每组10 只。I/R 模型组：结扎左前降支(LAD)进行30 min局部缺血，然后保持120 min的稳定灌注。黄腐酸钠高、中、低剂量预处理组：黄腐酸钠组按其各自剂量，于术前1 周用黄腐酸钠水溶制剂灌胃预处理，1 次/d，其他操作同I/R 模型组。假手术组：假手术的大鼠进行与I/R 模型组完全相同的程序，除了在LAD 下通过的缝合线保持不结扎状态。各组大鼠均在术前12 h 禁食不禁饮。②MIRI 模型建造：依据文献方法，以20%乌拉坦0.5 mL/100 g 的剂量进行大鼠腹腔注射麻醉，麻醉后将大鼠取仰卧位固定于操作台，行气管插管并连接动物呼吸机(频率60 次/min，潮气量15 mL/kg)，插入针型电极于四肢皮下进行心电监测[3]。剃除胸部鼠毛并进行消毒，随后由胸骨左缘心搏最明显处纵向切开皮肤，弯钳钝性分离肌肉组织，暴露肋骨之后将3～5 肋剪断，剥离心包充分暴露心脏，将4-0带针丝线穿过冠状动脉左前降支(LAD)下方后，将一个小的1 mm聚乙烯管(PE)放在LAD顶部，并将缝合线结扎在PE管的顶部，而不会损坏动脉。手术全程心电监护，根据心电图及左室前壁心肌颜色变化来判断造模成功与否。结扎后心电图显示出相应的ST 段升高，伴随着左心室颜色逐渐变暗可确认缺血；缺血30 min 后，通过切开该PE管顶部的线结去除结扎，观察缺血区心肌恢复红润和ST 段回落幅度高于50%的改变确认再灌注。③造模结果：试验中各组均有l～2 只大鼠由于心室颤动、大出血及气胸等因素死亡，将其排除，其他剩余每组8只大鼠进行相关试验室指标检测。④标本采集：再灌注120 min 后，立即游离颈总动脉，于颈总动脉处取血并摘取大鼠心脏。血液装于试管中进行离心(3 000 r/min，10 min)，采血清于EP 管中冷藏保存备用。⑤指标检测：检测心肌梗死面积(NBT 染色)；对心肌组织进行形态学观察；测定相关的血清指标：应用全自动生化分析仪(日本东芝公司，TBA-120)测定肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白T(cTnT)含量；使用试剂盒对血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)行分析，其中SOD、MDA 试剂盒是购买自南京建成生物工程研究所，而IL-6和TNF-α含量检测试剂盒购买自RD公司。

统计学方法：数据采用SPSS 18.0软件分析；计量资料以(±s)表示，采用t检验；P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

心肌梗死面积：与假手术组比较，I/R 模型组梗死面积增加，差异有统计学意义(P＜0.05)；说明MIRI大鼠模型构建成功；与I/R模型组比较，黄腐酸钠各组心肌梗死面积均缩小，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图1。

图1 心肌梗死面积

心肌组织形态学改变：假手术组心肌纹理规整清晰，心肌纤维排列整齐，细胞正常无水肿、出血迹象，无炎性细胞浸润。I/R 模型组心肌纤维扭曲杂乱，心肌细胞水肿并伴有变性和坏死，存在部分炎性细胞浸润。黄腐酸钠各组心肌组织的结构形态介于I/R模型组和假手术组之间，并且炎性细胞浸润有所减轻，见图2。

图2 心肌组织形态学改变

各组大鼠血清CK-MB和cTnT含量比较：与假手术组相比，I/R 模型组血清CK-MB 和cTnT 含量增加，差异有统计学意义(P＜0.05)；与I/R 模型组相比，黄腐酸钠各剂量组CK-MB和cTnT水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；且呈剂量依赖性。见表1。

表1 各组大鼠血清CK-MB和cTnT含量比较(±s)

表1 各组大鼠血清CK-MB和cTnT含量比较(±s)

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与I/R模型组比较，#P＜0.05

组别 剂量(mg/kg) CK-MB(U/L) cTnT(pg/mL)假手术组 8 39.46±3.96 406.51±27.50 I/R模型组 8 112.35±6.21* 1652.37±202.21*黄腐酸钠低剂量组 50 103.02±8.60# 1554.45±139.34#黄腐酸钠中剂量组 100 78.82±8.19# 1264.26±111.80#黄腐酸钠高剂量组 150 63.15±8.21# 1022.19±129.12#

各组大鼠血清IL-6和TNF-α水平比较：与假手术组相比，I/R 模型组IL-6 和TNF-α水平提高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与I/R 模型组相比，黄腐酸钠各剂量组IL-6和TNF-α水平显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；且呈剂量依赖性。见表2。

表2 各组大鼠血清IL-6和TNF-α水平比较(±s)

表2 各组大鼠血清IL-6和TNF-α水平比较(±s)

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与I/R模型组比较，#P＜0.05

组别 剂量(mg/kg) IL-6(pg/mL) TNF-α(pg/mL)假手术组 8 106.48±9.13 32.50±2.91 I/R模型组 8 187.84±8.96* 92.83±7.74*黄腐酸钠低剂量组 50 172.33±9.19# 78.81±7.49#黄腐酸钠中剂量组 100 152.05±15.06# 68.39±8.32#黄腐酸钠高剂量组 150 144.14±13.79# 53.65±3.38#

各组大鼠血清SOD 活性和MDA 含量比较：与假手术组相比，I/R模型组SOD活性减少且MDA含量提高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与I/R 模型组相比，黄腐酸钠各剂量组SOD 活性均升高，而MDA 含量下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清SOD活性和MDA含量比较(±s)

表3 各组大鼠血清SOD活性和MDA含量比较(±s)

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与I/R模型组比较，#P＜0.05

组别 剂量(mg/kg) SOD(U/mL) MDA(μg/uL)假手术组 8 50.94±4.67 39.50±4.54 I/R模型组 8 20.60±3.06* 94.85±7.36*黄腐酸钠低剂量组 50 24.82±4.09# 79.71±9.37#黄腐酸钠中剂量组 100 33.87±4.30# 73.77±6.35#黄腐酸钠高剂量组 150 36.72±6.13# 64.24±7.28#

讨 论

cTnT和CK-MB是目前临床上比较认可的心肌损伤标志物，对于诊断心肌梗死、评价溶栓效果及再灌注损伤程度具有重要意义[4]。本试验中黄腐酸钠预处理可以降低CK-MB、cTnT 含量，并且心肌梗死面积较模型组显著减少，证实黄腐酸钠能够改善心肌损伤情况。同时，黄腐酸钠各剂量组的心肌纤维排列规整，炎性细胞浸润减少，提示黄腐酸钠预处理可以减轻再灌注后心肌组织形态损伤的程度[5]。

心肌组织拥有氧耗高且不可再生的特性，当机体组织缺血缺氧时，SOD活性被抑制，脂质过氧化反应生成具有细胞毒性的产物MDA，并导致中性粒细胞激活和炎症细胞因子TNF-α和IL-6的释放，引起心肌组织的损伤[6]。研究显示，药物预处理能够提高血清中SOD的活性，改善机体氧自由基产生与清除的平衡状态，从而很好地减轻组织细胞所受到的伤害[7]。本研究发现，黄腐酸钠预处理组可以使缺血区域心肌组织血清中SOD 活性增强，MDA、TNF-α、IL-6 水平降低，说明黄腐酸钠能够减轻氧化应激并抑制炎性反应，从而起到对心肌的保护作用。

综上所述，黄腐酸钠预处理可以保护心脏免受I/R损伤，其作用机制与抑制氧化应激及炎性因子的释放相关联。