β-地中海贫血患者82例基因型与临床表型分析

翟英超 吴洁

571434海南博鳌一龄生命养护中心检验科，海南琼海1

570100海南医学院热带医学与检验医学院，海南海口2

β-地中海贫血属于一种单基因遗传疾病，在全世界具有较高的发病率，严重危害人们的身心健康，该病发病原因为β-珠蛋白肽链的合成减少或缺失、β-珠蛋白基因的缺陷，引起患者血红蛋白的不稳定状态以及红细胞破坏后产生的以溶血性贫血为主的症状群，其临床症状主要是不同程度的慢性进行性溶血性贫血[1]。我国β-地贫发生率较高的区域在长江以南各省，其中最为严重的省份为广西、广东以及海南等，海南人群的携带率估计约2.7%[2]，而海南黎族人群高达8%～11.6%[3]。当夫妇双方均为地贫携带者时，就有可能出现由于基因缺失而导致的重症地贫，甚至是妊娠晚期死胎或新生儿死亡。因此，重型地贫儿出生、优生优育的重要措施是筛查地贫，必要时孕妇需进行产前诊断。本文对海南β-地贫患者的基因突变类型、基因型和临床表型进行了分析，以明确β-地贫患者的基因分布及其临床特点，为β-地中海贫血筛查、诊断和防治提供依据。

资料与方法

选取2015-2016年收治β-地贫患者82例，男26例，女56例；年龄2个月～71岁。其中轻型48例、中间型15例和重型β-地贫19例。

检测试剂和仪器：亚能生物技术有限公司提供的全血DNA快速提取试剂盒和β-地贫基因检测试剂盒；全自动CD3700血细胞分析仪；韩国Finepcr Hybridization incubator combi-H12杂交仪；罗氏Cobas480型聚合酶链反应扩增仪；美国BIO-RAD variant高效液相色谱仪及配套试剂和质控物。

方法：⑴标本来源：收集β-地贫患者EDTA-K2抗凝全血1 mL，立即送检作血常规和HPLC检测，剩余标本-20℃保存备用。⑵血常规检测：采用全自动血细胞分析仪对红细胞有关数据(血红蛋白含量、红细胞计数、平均红细胞血红蛋白含量、平均红细胞体积、红细胞压积以及红细胞体积分布宽度)进行检测，要求操作者严格按照操作说明书执行。⑶血红蛋白亚型水平检测：采用HPLC仪对血红蛋白亚型HbA2及HbF含量进行检测，要求严格按照仪器操作说明书执行。⑷β-地贫基因检测：①全血DNA提取：基因组DNA的提取采用全血DNA快速提取试剂盒的操作说明书执行，DNA质量的鉴定提取采用1.2%的琼脂糖凝胶电泳法，设置电压为4V/cm。②PCR扩增：β-地贫PCR反应体积25 μL，扩增条件为50℃15 min、95℃变性10 min、35个循环(94℃1 m→55℃30 s→72℃30 s)、72℃延伸5 min。每次均设阴性、阳性对照。③扩增产物分析：β-地贫常见18种突变类型的检测方法：取β-地贫扩增产物25 μL，反向点杂交法(RDB)，要求严格按照试剂盒操作说明书执行。

统计学处理：直接计算概率。

结 果

β-地贫患者基因突变类型：82例患者中共检出6种β-地贫基因突变类型，即 CD41-42(-TTCT)、IVS-Ⅱ-654(C→T)、-28(A→G)、CD17(A→T)、CD71-72(+A)及异常血红蛋白βE。CD41-42(-TTCT)突变最为常见，其次是IVS-II-654(C→T)、-28(A→G)，其他类型较为少见，见表1。

β-地贫患者基因型及其表现型：82例β-地贫患者共有10种基因型，以41-42M/N最常见，其次是41-42M/M、654M/N；其对应表现型以β0杂合子所占比例最高(62.19%)，其次为β0纯合子(23.17%)。

各临床型β-地贫基因型：48例轻型β-地贫患者绝大多数基因型为β0/βN，少数为β+/βN；15例中间型β-地贫患者基因型较为复杂，大多也为β0/βN，其他还包括β+/β+、β0/β+及β0/βE；19例重型β-地贫患者基因型均为β0/β0。β0/βN患者既可表现为轻型，也可表现为中间型。

各临床型β-地贫患者红细胞参数和血红蛋白亚型分析：红细胞参数结果显示82例β-地贫患者中表现为小细胞低色素性贫血者共67例(81.71%)；11例(13.42%)患者仅MCV、MCH降低，而无贫血；4例(4.88%)患者正常。轻型、中间型和重型β地贫患者中为小细胞低色素性贫血者所占比例分别为75%、80%和100%；β0杂合子和β+杂合子患者中各有76.47%和62.50%表现为小细胞低色素性贫血，其他表型均表现为小细胞低色素性贫血。

表1 β-地贫基因突变类型及突变频率

讨 论

本研究中82例β-地贫患者检查显示小细胞低色素性贫血占比81.71%，其中轻型、中间型以及重型占比分别为75%、80%和100%，可见大部分β-地贫患者可通过血细胞分析筛选出来[4]。近年来，HPLC被广泛用于血红蛋白亚型定量分析，研究显示，除了静止型，其他的地贫类型均可采用Hb亚型定量检出，且其敏感性和特异性较高。我们发现经HPLC筛选的病例经基因检测几乎全部均为β-地贫，可见HPLC检测Hb亚型含量对β-地贫有较高的诊断价值。本研究中大部分轻型β-地贫患者HbA2＞3.5%(79.17%)，而中间型仅有6例HbA2＞3.5%(40%)，中间型和重型地贫患者均以不同程度HbF增高为主。可见，红细胞参数、Hb亚型分析对早期筛查β-地贫有重要价值，而将两者联合检测则更为准确[5]。

海南作为地贫高发区，在人群中开展地贫筛查和遗传咨询、重视并加强产前诊断有助于防止重症地贫患儿的出生。通过分析本地区常见β-地贫基因缺陷类型、基因型和表型、各临床型β地贫基因型及其表型、β-地贫血液学特点，使我们更加了解海南β-地贫特征，并能更好的防治地贫。