下调MTDH表达抑制胶质瘤U87细胞增殖、迁移与侵袭

张金灿 廖勇仕

摘要 目的：探讨下调异黏蛋白（MTDH）的表达对胶质瘤细胞U87增殖、迁移和侵袭的影响。方法：使用脂质体将MTDH干扰小RNA（MTDH siRNA）转染U87细胞（处理组），同时用si-NC转染U87细胞作为阴性对照（对照组）。利用qRT-PCR验证转染后U87细胞的MTDH表达水平。通过MTT法、细胞划痕、transwell侵袭实验观察下调MTDH的表达对U87细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果：处理组细胞的MTDH表达量明显下调，表明转染MTDH siRNA能有效下调U87细胞的MTDH表达。MTT实验表明，与对照组细胞相比，处理组的细胞增殖速度明显下降。细胞划痕实验显示下调MTDH的表达抑制了细胞的迁移能力。Transwell侵袭实验显示，处理组的细胞侵袭能力较对照组细胞明显下降。结论：下调MTDH的表达能抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，MTDH可成为治疗胶质瘤的潜在靶点。

关键词 胶质瘤;MTDH;细胞增殖;细胞侵袭

异黏蛋白（MTDH）又称星型胶质细胞上调基因-1（AEG-1），在多种肿瘤中高表达，如乳腺癌、肝癌、结直肠癌等[1-3]。研究表明，MTDH可通过P13K/AKT，NF-κB及Wnt/β-catenin等信号通路，调控肿瘤的发生发展，其高表达与肿瘤转移、耐药、血管生成、预后差相关。然而MTDH在胶质瘤发生发展中的作用尚不清楚。本研究通过小RNA干扰技术（siRNA）沉默内源性MTDH，下调MTDH的表达，研究下调MTDH对胶质瘤细胞U87增殖、迁移和侵袭的影响，探讨MTDH在胶质瘤中生物学功能，对将MTDH发展成一个治疗胶质瘤的新靶标，改善胶质瘤的预后具有重要意义。

资料与方法

实验材料：MTDH siRNA及qRT-PCR检测试剂盒，转染试剂脂质体2000。

细胞培养：胶质瘤细胞株U87购置上海细胞研究所，在5% CO₂、37℃条件下，培养于含10%小牛血清的RPMI1640中。

细胞转染：分为处理组（MTDHsiRNA）与对照组（si-NC），接种细胞于96孔板完全培养基中，细胞生长至30%～50%密度;无菌EP管配好转染试剂及siRNA于无血清培养液，室温放5min，按操作程序转染细胞，置于37℃、5%COz培养箱中，6h后换液，加入完全培养基继续培养48h，收集细胞。

qRT-PCR检测MTDH表达水平：qRT-PCR反应：反应体系20μL，包括5μmol/L MTDH特异PCR引物0.4μL、稀释后的RT產物2μL、5U/μL耐热DNA聚合酶0.2μL、2×qRT-PCR缓冲液10μL、灭菌双蒸水7.4μL。反应条件：95℃3min活化Tag酶，然后95℃12s、62℃35s，共40个循环。

MTT法检测细胞增殖活性：MTDH处理U87细胞24h，0.25%胰酶消化，吹打成单细胞悬液离心。用含10%小牛血清RPMI-1640培养基稀释成5×10⁴个/mL细胞悬液，取200μL接种于96孔板中，设复孔5个。置于37℃、5%CO₂培养箱48h。每孔加灭菌MTT液（5mg/mL）20μL。选择570nm波长，酶标仪检测各孔吸光值并记录。实验重复3次。

细胞划痕和transwell侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力：MTDH转染U87细胞48h后，消化细胞，用无血清培基洗涤2次，按操作进行。

统计学处理：采用SPSS19.0分析数据，计量资料用（x±s）表示，采用t检验;计数资料用（%）表示，采用χ²检验。P<0.05差异有统计学意义。

结果

下调MTDH后U87细胞增殖速度下降：与对照组细胞（1.00±0.06）相比，转染MTDH siRNA后处理组细胞MTDH的表达量（0.28±0.01）明显下调，差异有统计学意义（P<0.05），表明MTDH siRNA能有效下调U87细胞的MTDH表达。然后，我们通过MTT法检测下调MTDH对U87细胞增殖的影响。结果显示，转染MTDH48h后，与对照组细胞（0.564±0.01）相比，处理组细胞的增殖速度（0.234±0.02）明显减慢，差异有统计学意义（P<0.05）。

下调MTDH后U87细胞迁移能力下降：与对照组细胞（0.57±0.02）相比，细胞划痕48h后处理组细胞划痕愈合率（0.25±0.03）明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。提示下调MTDH表达能够在一定程度上抑制U87细胞迁移。

下调MTDH后U87细胞侵袭能力下降：我们将细胞接种于Transwells小室，置于24孔板，48h后取出Transwells小室固定，结晶紫染色，显微镜下计数5个视野穿出的细胞数。统计分析发现，与对照组细胞（253.2±12.30）相比，处理组细胞的侵袭能力（108.6±9.29）明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。提示下调MTDH表达明显抑制U87细胞的侵袭能力。

讨论

胶质瘤是目前临床中较为常见的一种中枢神经系统肿瘤，其临床治疗效果差，容易复发，对患者的健康和生活产生严重的影响。在目前的医疗技术手段下，针对胶质瘤患者，主要采用手术治疗，然后结合放疗和化疗进行治疗，但治疗效果欠佳，并且无论手术治疗还是放化疗，均会对患者的身体产生较大的损害，给患者身体和精神上造成严重的打击，严重降低患者的生活质量，也给患者家庭和社会带来沉重的经济负担。随着对胶质瘤发生和发展过程研究的深人，其具体的发病机制方面已取得了重大的突破，但针对其治疗，尚没有研究出更好的手段，其治疗效果和预后无较大的改善，尤其在一些恶性程度较高的胶质瘤患者中，预后极差[4]。

目前基因诊断和基因治疗是研究的热点，许多学者在该领域开展了大量的研究，目前研究的主要思路是寻找一个明确的作用靶点，然后通过作用于该靶点来阻断基因的表达，从而影响到其后的信号通路，抑制肿瘤细胞的增殖，并促进其逐渐凋亡。目前临床中已发现多个作用靶点，而其中最为重要的一个就是MTDH，其已被证实在多种肿瘤中表达升高，与肿瘤的发生发展、侵袭、转移及耐药相关，是肿瘤诊断、治疗及预后评价的一个重要靶点。研究发现，干扰MTDH表达可抑制食管癌细胞增殖，使细胞周期阻滞在S期[5]。下调MTDH基因表达，还可以抑制乳腺癌细胞上皮间质转化，降低其侵袭和迁移能力[6]。表明MTDH抑制剂不仅可以抑制肿瘤生长，而且还能降低肿瘤转移的风险，具有成为肿瘤新疗法的前景。但MTDH在胶质瘤发生发展中的作用尚需进一步研究。

有研究者报道miR-22可通过靶向抑制MTDH的表达从而抑制胶质瘤细胞的增殖[7]。本研究通过在胶质瘤细胞U87中转染MTDH siRNA，观察下调MTDH表达对U87细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。MTT试验结果表明下调MTDH能明显抑制胶质瘤细胞的增殖能力。我们的试验结果表明下调MTDH能抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力，MTDH可能成为治疗胶质瘤的潜在靶点。

但MTDH的功能特性及治疗潜能还有待进一步研究确认。在将来的研究中，我们仍会重点倾向于研究MTDH在胶质瘤中的功能和机制，使该领域的研究更加深入，并逐步探讨其在胶质瘤治疗中的应用前景，为胶质瘤的防治提供依据。

参考文献

[1]刘焱，陈晨，林敏.MTDH在浸润性乳腺癌不同分子亚型中的表达及临床意义[J].现代肿瘤医学，2017，25（4）：574.

[2]廖粤军，刘红光，李汉贤.MTDH在66例原发性肝癌组织中的表达及临床意义分析[J].中南医学科学杂志，2017，45（3）：295.

[3]张伟，方子乔，吉化春.结肠腺癌组织MTDH和MMP-9表达临床意义研究[J].中华肿瘤防治杂志12015，22（10）：786-791.

[4]李国亮，王选重，田沁森，等.脑胶质瘤综合治疗新进展[J].转化医学电子杂志，2017，4（7）：16-20.

[5]杨晨晨，贺家勇，郑树涛.MTDH靶向RNA干扰质粒构建及其对食管癌细胞EC9706的影响[J]新疆医科大学学报，2015，5（11）：1362.

[6]刘兆品，曹恒，丁震宇.下调MTDH基因表达对乳腺癌细胞转移潜能影响机制研究[J].中华肿瘤防治杂志，2014，21（8）：575-579.

[7]李荣国，王剑，杨少陵.miR-22通过靶向MTDH抑制胶质瘤细胞的生长[J].中国癌症杂志，2014，2（6）：401.