贵州省结直肠癌Kras基因突变分析及临床意义

梁跃 李光学 马庆庆

摘 要 目的：探讨结直肠癌组织Kras基因突变情况及其与部分临床病理特征的关系。方法：采用荧光定量PCR法检测贵州省60例结直肠癌组织中Kras基因突变情况。结果：Kras基因突变率为31.67%，以第12密码子突变为主；突变类型6种，G12D突变率最高；Kras基因突变与结直肠癌患者年龄、性别及肿瘤部位无明显相关性，与吸烟、饮酒也无关联性。结论：结直肠癌临床检测中对Kras基因突变进行分子检测，可正确指导临床用药和科学选择治疗方案，从而进行更有效的靶向治疗。

关键词 结直肠癌；Kras基因；基因突变

结直肠癌（CRC）是世界范围内的常见恶性肿瘤之一，虽然以手术切除、化学药物治疗和放射治疗为主的综合治疗取得了一定进展，但CRC的治疗仍然面临巨大挑战。目前化疗是CRC术后最主要的治疗手段之一，而部分患者却疗效甚微或者无效，有些患者甚至产生不良反应，导致用药失败。据统计，CRC化疗的有效率仅30%，有多达700/0的CRC患者对化疗药物无效。随着靶向治疗药物表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂西妥昔单抗和帕尼单抗的问世，CRC的治疗进入了靶向治疗时代。Kras是EGFR信号转导通路中一个重要的下游调控基因，突变型的Kras无需ECFR接收信号，能够自动活化该通路并启动下游信号的转导，只有野生型Kras基因患者才对抗EGFR单克隆抗体治疗有效，而突变型的患者无效。因此，Kras基因突变的检测与分析对CRC患者治疗方案的选择，尤其在选择西妥昔单抗等靶向治疗药物上具有重要意义。该研究分析2015年10月-2017年6月60例贵州省内CRC患者病灶组织的Kras基因突变情况，探讨其临床意义，为个体化靶向治疗CRC提供基础依据。

资料与方法

选择2015年10月-2017年6月间贵州航天医院收存的贵州地区CRC石蜡包埋标本60例，男27例，女33例；年龄20～72岁，平均（46.07±1.58）岁。记录已确诊CRC患者的年龄、性别、吸烟、饮酒、高血压等一般信息。

试剂与仪器设备：FFPE样品DNA分离试剂盒（艾德，中国），人类KRAS基因7种突变检测试剂盒（艾德，中国），Nanodropl000微量核酸测定仪，ABI7500荧光定量PCR仪等。

方法：①提取石蜡切片DNA：提取2～5片10μm的组织切片，利用二甲苯脱蜡，经离心处理后，取上清液加入lmL无水乙醇，震荡离心后静置沉淀，使用厦门艾德生物医药科技有限公司的FFPE样品DNA分离试剂盒，按照说明书步骤进行组织切片DNA的提取。用DNA微量分光光度计测定所提DNA的浓度及纯度（OD260/OD280）。②PCR扩增：将所提DNA进行稀释，以DNA为模板，使用人类KRAS基因7种突变检测试剂盒，在荧光定量PCR仪中进行实时荧光定量PCR扩增，记录Kras基因突变情况。

统计学方法：采用SPSS 20.0分析，计量资料采用（x±s）表示，采用t检验；计数资料采用率（%）表示，采用X2检验，P< 0.05表示差异有统计学意义。

结果

Kras基因突变情况：贵州省60份组织中，Kras基因突变19例（31.67%），其余均为野生型，其中第12位密码子突变16例（84.21%），第13位密码子突变3例（15.79%），未检出第12、13位密码子同时突变。贵州省CRC患者Kras基因突变类型显示，本研究Kras基因突变类型有6种，主要为第12密码子突变，约84.21%（16/19），其中G12D突变最高，约42.ll%（8/19），见表l。

Kras基因突变与年龄、性别及肿瘤部位的关系：Kras基因突变和CRC患者的年龄、性别及肿瘤部位无显著相关性（P>0.05），见表2。

Kras基因突变与吸烟、饮酒的关系：纳入的60例患者中，吸烟12例，发生Kras基因突变l例，不吸烟48例，发生Kras基因突变15例，两者间差异无统计学意义（P=0.890）；饮酒16例，发生Kras基因突变5例，不饮酒44例，发生Kras基因突变14例，两者间差异无统计学意义（P=0.967）。

讨论

EGFR在许多实体瘤组织中高表达，CRC高居第2位，且EGFR阳性率越高，肿瘤的恶性程度也会越高、侵袭力越强、预后越差同。近年研究显示，靶向药物西妥昔单抗治疗的有效性受其Kras基因状态的影响。Kras基因是EGFR信号转导通路中一个重要的下游调控基因，突变型的Kras无需ECFR接收信号，能够自动活化该通路并启动下游信号的转导从而也促进CRC的发生、发展。近年大量数据已表明，抗EGFR单克隆抗体药物在野生型Kras基因CRC患者中有较好的疗效，Kras基因突变被认为是对抗ECFR单克隆抗体药耐药的独立影响因素。国内外报道Kras基因突变率30%～40%，且常见突变发生在2号外显子的第12、13位密码子，常见突变类型包括C12D、C12V、G12A、G12S、G12C、G13D，可发生双突变或者三突变。本研究共检测出19例Kras基因突变，突变率31.67%；突变主要发生在第12位密码子上（16例，84.21%），未检测到双突变或三突变；在6种突变类型中G12D[8例（42.1 1%）]、G12V[4例（21.05%）]和C13D[3例（15.790/0）]突变率较高，与国内外已报道数据基本一致。这表明贵州省CRC患者中也存在较高的Kras基因突变率，突变患者将不能从抗ECFR的靶向治疗中获益，因此建议CRC患者在用靶向治疗药物（如西妥昔单抗等）之前应先检测Kras基因突变情况，正确选择抗EGFR单抗药，从而进行最有效的分子靶向治疗。

目前Kras基因突變与CRC患者临床病理特征之间的关系研究尚未得出一致结果。此前有报道分析966例中国CRC患者Kras基因突变，认为Kras基因在右半结肠癌女性患者中的突变率高，且与患者年龄也有关系。也有研究报道，Kras基因突变更易发生于女性患者，而与其他病理特征无相关性。本研究发现贵州省CRC患者Kras基因突变与患者性别、年龄及肿瘤部位并无明显相关性。Kras基因突变与病理特征之间关系的研究结果各有差异，可能与检测方法的选择不同、样本量悬殊及地区差异等因素有关。另外研究未发现CRC患者Kras基因突变与吸烟、饮酒之间存在相关性，提示CRC患者Kras基因突变可能不受吸烟与饮酒因素的影响，鉴于病例数较少，仍需进一步扩增病例进行探讨。