桂枝加芍药汤颗粒指纹图谱及多指标成分含量测定方法研究

李明 李蕊 张佳诺 付静

摘要 目的：探讨桂枝加芍药汤颗粒指纹图谱及多指标成分含量测定方法。方法：采用岛津高效液相色谱仪（LC-2010A），以乙腈-0.1%磷酸为流动相进行梯度洗脱，对标志性成分进行测定。结果：建立了桂枝加芍药汤指纹图谱、标定了5个共有峰，指认其中3个峰并对其进行含量测定。结论：本研究所建立的指纹图谱及多指标含量测定方法能较好地评价桂枝加芍药汤颗粒的质量，并可提高该制剂的质量标准，为保证产品质量奠定基础。

关键词 桂枝加芍药汤；HPLC指纹图谱；芍药苷

桂枝加芍药汤出自《伤寒论》，常用于施治脾阴亏损、肠道失润所致便秘、腹胀满、口唇干燥的老年习惯性便秘患者^[1]。本方由桂枝、白芍、生姜、大枣、炙甘草组成。方中重用阴柔之芍药滋养脾阴，复用味甘之炙甘草、大枣佐芍药补益脾阴^[2]。方中用桂枝、生姜等阳药是为脾阴不足、运化失职、气机壅遏所致之腹胀满而设。如此配伍，动静结合，共奏滋养脾阴、调畅气机之功，则斯症愈矣。桂枝加芍药汤作为中药传统经典方已经经过了长期的临床使用，不仅具有疗效确切以及不良反应较少的优势，而且来源于传统，更突出了中医药特色。但是通过检索文献发现，未能检索到对桂枝加芍药汤质量控制的方法。桂枝加芍汤中活性成分复杂多样，为弥补质量评价的不足，本实验采用高效液相色谱法建立了桂枝加芍汤颗粒的指纹图谱，并同时对其中3种活性成分进行控制，从而为深入研究桂枝加芍汤颗粒的药效物质基础、配伍基础提供了有效的分析手段，为经典名方的开发提供参考依据。

材料

仪器：岛津高效液相色谱仪（LC-2010A），KQ-3000DB超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；MettlerToledo AL104电子天平（瑞士梅特勒一托利多公司，精度：0.001 g），Mettler ToledoXP26电子天平（瑞士梅特勒一托利多公司，精密度：0.01 mg）。

试药：乙腈（色谱纯，411瓶飞世尔批号：146971），水为屈臣氏蒸馏水（4.5 L/瓶，广州屈臣氏食品饮料有限公司北京饮料分公司），磷酸为分析纯（500 mL/瓶，国药集团化学试剂有限公司，批号：20141104）。桂枝加芍药汤颗粒南北京康仁堂药业有限公司自制^[3-5]；芍药苷对照品（批号：110736-201640，购于中国食品药品检定研究院）；甘草苷（批号：111610-201106购于中国食品药品检定研究院）；甘草酸铵对照品（批号：110731-201116，购于中国食品药品检定研究院）。

方法与结果

色谱条件：①色谱柱：美国安捷伦科技有限公司Agilent C18（4.6 mm × 250 mm，5μm）；检则波长267 nm，流速1 mL/min；②柱温：25℃；進样量10 μL；③流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B）采用下表梯度洗脱^[6]。见表1，进样量10 μL，色谱图，见图1。

供试品溶液的制备：取桂枝加芍药汤颗粒约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加蒸馏水50 mL，称定重量，超声处理15 min，使溶解，放冷，再称定重量，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性样品制备：制备缺白芍、缺炙甘草阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性溶液。

对照品溶液的制备：精密称取芍药苷适量，加甲醇制成每1 mL含芍药苷60μg；精密称取甘草苷、甘草酸铵对照品适量，加70%乙醇制成每1 mL含甘草苷20μ斗g、含甘草酸铵0.2 mg的混合对照品，即得。

方法学考察^[7，8]：①精密度试验：取同一供试品溶液，在2.1项下的色谱条件下重复进样6次，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积（参比峰为甘草苷）的RSD均<3%，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱的技术要求。②稳定性试验：取同一供试品溶液，在2.1项下的色谱条件下，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均<3%，表明供试品溶液在24 h稳定。③重复性试验：取同一批桂枝加芍药汤颗粒6份，按2.2项下制备供试品溶液，在2.1项下的色谱条件下，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均<3%表明该方法重复性良好，符合指纹图谱的技术要求。

指纹图谱建立及相似度分析：桂枝加芍药汤颗粒的HPLC指纹图谱的建立：取10批桂枝加芍药汤颗粒样品，分别按供试品溶液的制备和检测方法进行检测，记录指纹图谱。因甘草苷峰面积相对加大且稳定，故以其为参照峰，计算各共有峰相对保留时间，10批样品共有峰相对保留时间的RSD均<0.5%符合指纹图谱的要求。运用中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”对10批样品的指纹图谱进行分析，设定样品1为参照图谱。选取9个特征峰进行多点校正，自动匹配，生成对照指纹图谱，见图2。匹配后的10批样品谱图见图3，然后进行各样品相似度评价，样品1～10的相似度分别为0.987、0.978、 0.987、 0.988、 0.994、 0.978、0.979、0.981、0.979、0.971。10批桂枝加芍药汤颗粒指纹图谱相似度均>0.90，符合指纹图谱要求。

含量测定方法与结果^[9]

色谱条件：按2.1项下色谱条件进行检测，以3种对照品计算理论塔板数>5 000，分离度> 1.5。

对照品溶液的制备：精密称取芍药苷适量，加甲醇制成每1 mL含芍药苷60 μg；精密称取甘草苷、甘草酸铵对照品适量，加70%乙醇制成没1 mL含甘草苷20μg、含甘草酸铵0.2 mg的混合对照品，即得。

对照品溶液的制备：取桂枝加芍药汤颗粒约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加蒸馏水50 mL，称定重量，超声处理15 min，使溶解，放冷，再称定重量，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

线性范围的考察：精密称取芍药苷对照品12.18 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇使溶解，定溶至刻度，摇匀。分别吸取1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、9 mL、10 mL溶液置10 mL容量瓶中，加甲醇定溶至刻度，即得。取芍药苷对照品溶液10 μL注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件测定，记录峰面积，以色谱峰的峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，求得芍药苷的回归方程y=14 011x+14 883（R²=0.999 9） （R²=0.999 9），表明芍药苷0.122～ 1.218μg范围内线性关系良好。精密称取甘草苷、10.08 mg甘草酸铵对照品10.27 mg，置50 mL容量瓶中，加70%乙醇使溶解，定容至刻度，摇匀。分别吸取1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、9 mL、10 mL溶液置10 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，即得。取甘草苷、甘草酸铵混合对照品溶液10 μL注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件测定，记录峰面积，以色谱峰的峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，求得甘草苷的回归方程为y=2E+ 06x-3975.9（R²=0.9999），表明甘草苷在0.202～ 4.032μg范围内线性关系良好。求得甘草酸铵的回归方程y=533487x+8668.2（R²=0.9995），表明甘草酸铵在0.201～ 4.025μg范围内线性关系良好。见图4～6。

準确度实验：精密称取桂枝加芍药汤颗粒6份，每份0.5 g，置于50 mL容量瓶中，加水适量，超声溶解后，加入浓度为1.392 0 mg/mL的芍药苷、0.182 6mg/mL甘草苷、0.426 4 mg/mL的甘草酸胺混合对照品溶液5 mL，加水定容至50 mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按2.1项下色谱条件测定，测定芍药苷、肉桂酸、甘草苷的含量，并计算回收率，芍药苷平均回收率为104.1%，RSD为0.39%，甘草苷平均回收率为100.12%，RSD为2.72%，甘草酸铵平均回收率为100.45%，RSD为1.97%，回收率符合相关要求。见表2。

专属性实验：将2.3项所获得的阴性供试品溶液按2.1项下色谱条件进行测定，所得结果无阴性干扰，故本方法专属性较好，见图7。

样品测定：精密称取10批桂枝加芍药汤颗粒，分别按2.2项下制备供试品，按2.1项下条件测定，见表3。

讨论

指纹图谱与一测多评结合的优势：由于桂枝加芍药汤颗粒成分复杂多样，目前还没有针对桂枝加芍药汤相关的质量控制方法出现，故本实验采用梯度洗脱对桂枝加芍药汤颗粒中芍药苷、甘草苷、甘草酸铵含量进行测定，并同时建立了指纹图谱的研究方法。将指纹图谱技术与多指标成分定量技术相结合，建立了桂枝加芍药汤配方颗粒的质量控制方法。

定量指标的选择：桂枝加芍药汤中白芍养营阴，缓肝急，止腹痛。炙甘草益气和中，调和诸药。故本研究选取其中相对稳定的芍药苷、甘草苷、甘草酸铵作为质量控制成分；适合对桂枝加芍药汤颗粒质量进行完整表达。

色谱条件的选择：本实验参照相关文献，选择峰强度及分离度相对较好的267 nm作为检测波长，通过实验考察将乙腈-0.1%磷酸溶液作为梯度洗脱流动相，得到的色谱峰分离效果好，样品获得了合适的保留值，通过方法学的验证，所得检测结果RSD值均符合要求，故以上述建立的指纹图谱结合多指标成分定量方法及样品处理条件对桂枝加芍药汤颗粒进行指纹图谱比对及定量分析是可行的。

参考文献

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