胰蛋白酶法提取鱼腥草多糖工艺的优化

杜晶 汪珊

摘要 目的：正交试验筛选胰蛋白酶提取鱼腥草多糖的最佳工艺。方法：对胰蛋白酶添加量、温度、时间等因素采用L9（34）正交试验法，寻求最佳提取工艺。结果：最佳提取工艺为温度45℃，pH=7，酶加入比例2%），提取时间2.5h。结论：正交试验法可用于鱼腥草多糖胰蛋白酶提取工艺的优选。

关键词 鱼腥草多糖；胰蛋白酶；正交试验；最佳工艺

鲜鱼腥草属于蕺菜，以多糖得率、多糖含量为指标[1-4]，我们利用正交试验法对胰蛋白酶提取鱼腥草多糖的最佳工艺进行寻找，报告如下。

资料与方法

仪器和试剂：干品鱼腥草购于广州清平市场，经广东药学院中药鉴定教研室姬生国博士鉴定为三白草科蕺菜属植物Houttuvnia cordata Thunb的全草；胰蛋白酶（250 N.F.U/mg）；葡萄糖标准品；苯酚、浓硫酸、氨水、95%乙醇均为分析纯；苯酚试液（自配）[5]。UV1800紫外一可见分光光度汁；电热恒温水浴锅。SHB3循环水真空泵，GZX-9240MBE数显鼓风干燥箱，AY120电子天平。

方法：鱼腥草多糖含量测定方法的建立。①对照品溶液的制备：精称已恒重的葡糖糖对照品0.0982g，加水溶解并定容至100 mL，再取1 mL，定容至10 mL容量瓶中，得濃度0.0982mg/mL对照品溶液。②供试液溶液的制备：称取鱼腥草5.0g，按正交设计表提取，得粗多糖。精称已恒重的粗多糖0.1000g，加水定容至50mL，再移取1mL，定容至10mL，摇匀即得。③标准曲线制作：精密移取对照品0.0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置10 mL容量瓶水定容，于489 nm对吸收度A进行测定，以吸收度A对含量C进行回归，得回归方程：Y=8.428 6X-0.025 8，γ（相关系数）=0.995 9。结果表明良好的线性关系出现在葡萄糖0.0196-0.0588mg/mL的范围内。④重现性试验：对50℃干燥至恒重的鱼腥草粗多糖6份进行精密称取，分别置于100mL的容量瓶中复溶，再取2mL定容至10mL，按标准曲线项下的方法操作，测定吸光度，RSD=0.3%，表明用苯酚一硫酸法进行鱼腥草多糖的含量分析，重现性好，实验结果可靠。⑤样品多糖含量测定方法：取供试品溶液1mL，置于试管中，加1mL苯酚，5mL浓硫酸，振摇均匀，显色>40min。置UV1800型分光光度计中，于489nm测定吸收度。根据回归方程计算多糖含量。⑥样品多糖提取的得率：称取鱼腥草药材5.0g，按照正交设计表进行提取，得粗多糖。多糖得率=100%×（粗多糖的量/药材的量）。鱼腥草多糖的提取方法：精称鱼腥草药材5.0g，提取时按正交设汁表进行，提取液浓缩至原料重：溶液体积1：4，80%乙醇醇沉，静置>2h，抽滤，将滤饼取出，50℃烘箱烘干，得粗多糖。正交试验法优化胰蛋白酶提取鱼腥草多糖工艺：制定因素水平表，在单因素试验的基础上pH=7，以酶添加量、温度、时间为考察因素采用L9（34）正交试验法，衡量提取效率的客观指标选取多糖得率及含量，优选最佳提取工艺。

采用加权评分法对数据进行分析，把多糖得率、多糖含量与该列最大数值相比，再×100，即得该项得分。根据多糖得率（x）和多糖含量（y）的作用，确定两者的权重系数分别为0.4、0.6，加权求和两项指标得分，通过公式得到综合评分w=0.4x+0.6y。

结果

由表1得胰蛋白酶提取多糖的影响因素大小顺序：A>B>C，其中A、B因素各水平之间差异有统计学意义。最佳提取条件为AIBIC2，即pH=7.0加入胰蛋白酶2%，温度45℃，浸提时间2.5 h。胰蛋白酶酶法提取鱼腥草多糖L9（34）正交试验方案及结果，见表1。

讨论

本试验对胰蛋白酶提取鱼腥草多糖的工艺进行正交试验，用测量多糖的率和多糖含量为指标，综合各因素的影响，得最佳提取工艺：胰蛋白酶2%，40倍体积的pH=7，45℃温度下浸提2.5 h。该工艺既保证了得率，又提高了多糖含量，为鱼腥草多糖进一步研究提供了理论依据。

参考文献

[1]嵇文亚，孟江，徐玉茵.酸法提取鱼腥草多糖工艺研究[J].河南中医学院报，2008，23（136）：22-24.

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[3]孟江，周毅生，廖华卫.超声波提取鱼腥草多糖工艺研究[J].时珍国医国药，2008，19（1）：17-18.

[4]孟江周毅生，廖华为.正交试验法优化鱼腥草多糖水煎煮提取工艺[J].世界中西医结合杂志，2007，2（6）：341-343.

[5]余世春，徐金龙，汪海孙，等.苯酚一硫酸法测定小柴胡汤口服液多糖的含量[J].中成药，1993，15（3）：12