天然药物提取分离过程中冻融环节的控制

135000吉林天成制药有限公司 吉林通化

冻融即冷冻-融解，是一种比较常用的提取方法。是在-20℃以下冷冻，室温或恒定温度下缓慢融化的一种方法，是一种比较温和的破壁方式，可以避免高温对原料所造成的营养损失等不良影响，也是使细胞破裂较为彻底的方法。目前冻融法多应用于天然药物的提取，如李敏康[1]采用冻融法提取猪血纤维蛋白原，确定了提取工艺条件；崔素萍等[2]为了提高大米蛋白质的提取率，研究采用冻融及低频超声波处理大米浆体后，再用碱液法提取大米中的蛋白质，大米蛋白质的提取率可达92.6%；郭卫芸等[3]通过反复冻融法破壁啤酒废酵母的研究确定，当反复冻融次数为3次时，破壁率高，可溶性蛋白溶出率较高。不同提取剂和提取方法获得的柿多糖在抗氧化和抗菌方面表现出较大差异，说明提取的过程与其生物学效能密切相关[4]；温梓辰等[5]通过探究反复冻融法对枸杞多糖溶出率的影响，通过单因素试验和正交试验，验证反复冻融法对枸杞多糖的提取效果，反复冻融法提取枸杞多糖的最佳工艺组合为：解冻温度45℃，冻融次数4次，冻结时间3 h，冻结温度-28℃；魏文志等[6]研究发现可以冻融辅助超声波法提取小球藻多糖物质，回收率高。以上可以看到目前很多动植物的提取涉及冻融环节，且大多数提取物质为蛋白、多糖类，这类处理往往具有复杂的生产工艺环节，在整个工艺环节中大多使用1次或多次的冻融环节，以确保有效成分能够有效地提取及杂质能够彻底地分离，冻融的方式有多种，也有不同的冻融周期，往往在冻融的过程中会因冷冻时间、温度及解冻时间、温度的不同的对产品的质量产生巨大的影响，特别是解冻方式的选择，由于提取液体积大，解冻时间长，部分部位或物质可能会发生变质，因此解冻方式也是冻融能否成功的关键步骤。本文通过实例对几种解冻方式的对比分析，确定何种方式能够效率最高，并且满足生产需求。

应用实例

兔肌肉富含多肽、嘌呤等物质，通过反复冻融提取试验，可以将有效成分分离，其质量直接影响制剂的质量。多组分生化药品是一类特殊时期产生的特殊药品，目前虽然争议较大但是仍有很多此类产品被证明拥有很好的疗效，具有针对性强、毒性低、不良反应小以及易被人体吸收等特点。生化药品是从生物体分离、纯化所得，来源于动物体，包括氨基酸及衍生物、多糖、酶及辅酶、脂类、多肽于蛋白、核苷酸及衍生物、多组分提取物。为保证药品的有效性和安全性，这类药品更需要关注过程控制，保证过程中产品质量得到最严格的控制。本文主要研究兔肌肉提取物多个冻融环节为研究对象，确定每个环节的最佳冻融方式。

表1 冻融①不同缓化方式情况对比分析

表2 冻融②不同缓化方式情况对比分析

表3 冻融③④不同缓化方式情况对比分析

试验设计：⑴兔肌肉提取工艺简述：白条兔→冻融①→剔出有效成分→冷冻→冻融②→一次匀浆→冷冻→冻融③→二次匀浆→冷冻→冻融④→提取→冷冻→冻融⑤→一次超滤→冷冻→冻融⑥→二次超滤。以上可以看到兔肌肉的提取过程中需要6次的冻融环节。这些环节的控制会影响到药品质量的好坏。⑵批量：取白条兔300 kg，剔出有效部位后开始进行后续冻融研究工作。以上可以看到每批产品使用到原材料用量较大，冻融工作量复杂。⑶冻融标准：确保冻融彻底且无肌肉组织腐败气味产生。兔肌肉含有很多蛋白，多肽，氨基酸等营养物质，容易腐败，提取工艺需要保证产品质量。⑷“冻融①”方法的选择：此步骤需要将冷冻的白条兔缓化后将有效部分剔出转入下道工序。目前我们有3种缓化方式：①自然缓化方式：常温放于缓化盘内，隔夜缓化。②水浴缓化方式(浸泡缓化)：白条兔放于纯化水中，隔夜缓化。③常温循环泵缓化方式(流动水缓化)：生产当日放入循环缓化槽内缓化。⑸“冻融②”方法的选择：此步骤需要将冷冻的兔肉缓化后进行匀浆操作。①自然缓化方式：常温放于缓化盘内，隔夜缓化后开始匀浆。②常温水浴缓化方式：白条兔放于纯化水中，隔夜缓化后开始匀浆。③常温循环泵缓化方式：生产当日放入循环缓化槽内，缓化后开始匀浆。⑹冻融③④方法的选择：此两步骤的缓化均属于匀浆液缓化，内部物质相同，因此可选择一种缓化方式。①自然缓化方式：隔夜取出后进行二次匀浆或提取。②常温水浴缓化方式：隔夜取出后进行二次匀浆或提取。③恒温循环泵水浴缓化方式：隔夜取出后进行二次匀浆或提取。⑺冻融⑤⑥：此两个步骤的缓化均属于超滤前药液的缓化，缓化方式相同。①自然缓化方式：隔夜取出后进行超滤。②常温水浴缓化方式：隔夜取出后进行超滤。③恒温循环泵水浴缓化方式：隔夜取出后进行超滤。

结果与分析：冻融①方式的不同对质量的影响：冻融①解冻的是整只白条兔，由于缓化方式不同导致工艺用时，缓化结果也不同，虽然兔肌肉仅从外观性状上观察，但是缓化时间过长容易导致白条兔表面发生变化，容易导致在缓化过程中表面的微生物繁殖，产生不良影响，因此本步骤采用循环缓化槽缓化较理想。见表1。

冻融②方式的不同对质量的影响：此步骤中冻融的是从有效部位剔除的兔肌肉，由于兔肌肉长时间和空气或纯化水接触，容易滋生微生物，因此关键在于降低接触时间，快速达到缓化的目的。常温循环泵缓化既能够保证低温又能够保证快速缓化，是最为有效的一种缓化方式。见表2。

冻融③④方式的不同对质量的影响：兔肌肉提取物属于肌肉组织，是匀浆液，里面富含多肽、氨基酸等有机物质，极易在长时间常温的过程中造成微生物繁殖，而在提取物过程中，冻融彻底与否直接影响着本批次的含量情况。所以选择一种合适的缓化方式既能够保证含量又能够保证质量，综合恒温循环泵水浴缓化(18℃)方式较为合理。见表3。

冻融⑤⑥方式的不同对质量的影响：此步骤由于提取后药液密度较小，因此缓化速度较前几步稍快，但缓化方式的选择同样影响着缓化的效果。最终选择低温的方式能够将药液缓化彻底，进一步保证了药液的低温状态，能够保证产品质量。见表4。

结果与讨论

本文以兔肌肉提取物生产过程中的各个缓化环节为例，经过对比的方式进行各种缓化方式的选择，其目的就是为了最大限度的降低在缓化过程中所产生的微生物污染的风险，进一步保证产品的质量。可以看到在融化过程中我们使用了缓化槽，缓化槽是这样的一种装置它可以自动控温，通过采用夹层保温及顶盖保温的方式有效减少了环境温度导致的槽内温度升高。缓化过程中，缓化槽内加入潜水泵，这种潜水泵可以加快槽内水的流动，使整个缓化槽保持温度均匀一致。同时在控制的时候，我们采用水位固定、装载方式固定、加热方式固定、时间固定的方式有效保证了产品的批次间的一致性。同时我们设计了合适的装载容器，增大了缓化面积，缩短了缓化时长，更有利于缓化的均匀性。合适的容器，合适的温度时长，既让有效成分充分提取分离又控制了微生物的滋生，和降压物质的产生，使产品符合质量控制的要求。

表4 冻融⑤⑥不同缓化方式情况对比分析

本文以兔肌肉提取为例，找出天然药物提取分离过程中冻融环节最佳控制方式。本文所使用的恒温循环泵水浴法大大降低了缓化过程中的时间并增强了缓化的效果，可以有效防止由于局部温度升高引起的质量不合格问题，为指导天然药物提取分离过程中的冻融环节控制提供依据。