利用CRISPR/Cas9技术敲除K562细胞中的SMIM1基因*

杨佳璇 李明浩 李艾静 叶璐夷

由于稀有血型个体的血液资源有限，需要依赖于稀有血型库和低温保存献血者的血液[1]，并且用于鉴定抗高频抗原抗体的阴性试剂细胞不易获取。目前，布里斯托大学的科研人员[2]利用CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9）基因编辑工具，在红系细胞中敲除ABO、Rh、Kell、Duffy等常见的引起输血不相容的血型系统的基因，重构血型抗原的表型，以期制备出满足不同输血需求的可定制化红细胞以降低同种免疫反应的发生，这将具有极大的临床意义。

基于此，我们尝试利用CRISPR/Cas9技术敲除编码Vel高频抗原的基因。Vel血型抗原在人群中的比例高达99.9%以上[3]，该抗原由SMIM1基因编码，组成该基因的4个外显子中，仅第3号和4号外显子编码功能蛋白[4]。当3号外显子上第64至80位缺失17bp碱基发生纯和缺失突变时，会导致蛋白翻译读码框改变，提前终止翻译，产生了Vel（-）的稀有表型，该突变在Vel（-）个体中占据主体地位[4]。白种人群中发生17bp碱基缺失突变的频率为1.46%，非洲人群中的频率为0.56%[3]。作者所在单位团队曾在上海地区6 153名献血者中筛查出2名Vel（-）献血者[5]。而新疆伊犁地区3 328名献血者中有14名为缺失17bp碱基的杂合突变[6]。尽管我国对该表型的研究较少，但是由于同种免疫产生的抗-Vel抗体可造成血管内溶血和新生儿溶血病[7]，检测抗-Vel抗体所需的试剂红细胞也不易获取，这都对Vel（-）个体的输血产生不利影响。因此如果能够重构Vel血型抗原的表型，将为Vel（-）个体抗体鉴定和配血困难提供一个新的解决途径。

本研究选择具有红系分化能力的人红白血病细胞系K562进行实验[8]，利用易转染的293T细胞作为初筛细胞，通过Sanger测序初步筛选具有较高切割效率的sgRNA。之后通过慢病毒介导的方法将筛选后的sgRNA递送至K562细胞中，经Sanger测序和TA克隆检测，验证了CRISPR/Cas9技术结合慢病毒在K562细胞中敲除SMIM1基因的可行性，为后续构建Vel抗原表型阴性的细胞模型奠定基础。

材料与方法

1 材料与试剂 人胚肾293T细胞株和人慢性髓系白血病K562细胞株购自北纳生物公司；质粒PX458和lentiCRISPRv2序列源自张锋实验室。胎牛血清（货号：10099141C）、DMEM（货号：C11995500BT）、RPMI 1640（货号：C11875500BT）培养基购自美国Gibco公司；胰酶EDTA溶液（货号：S310KJ）购自上海源培生物科技股份有限公司；Xfect转染试剂（货号：631317）、LA Taq Hot Start Version（货号：RR042A）购自北京宝日医生物技术有限公司；慢病毒滴度检测卡（货号：BF06202-10）购自苏州博特龙生物科技有限公司；polybrene（货号：TR-1003-G）购自美国Sigma公司；嘌呤霉素（货号：60210ES25）购自上海翊圣生物科技有限公司；无内毒素质粒大提试剂盒（货号：DP117）、细胞基因组DNA提取试剂盒（货号：DP304）购自北京天根生化科技有限公司。PCR引物合成与测序在华大基因完成。

2 细胞培养 293T细胞为贴壁细胞，培养于DMEM培养基（含10%胎牛血清），经胰酶消化后进行传代。K562细胞为悬浮细胞，培养于RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清）。两种细胞均置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱培养，每两天传代一次，取对数生长期细胞进行实验。

3 sgRNA设计与质粒构建 利用NCBI（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库获得SMIM1基因CDS区序列，通过sgRNA在线设计网站（http：//crispr.dfci.harvard.edu）设计5条靶向SMIM1基因3号外显子的sgRNA序列（图1，序列见表1）。

表1 靶向SMIM1基因3号外显子的sgRNA序列

图1 5条sgRNA在SMIM1基因3号外显子中的位置图示

合成后的sgRNA序列分别克隆到载体质粒PX458中，构建敲除SMIM1基因并表达绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）的基因编辑元件，用以筛选具有高效切割效率的sgRNA序列。将筛选后的sgRNA序列克隆至载体质粒lentiCRISPRv2中，用于慢病毒的包装制备。质粒构建由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

将构建完成质粒的甘油菌接种于含有相应抗生素的LB液体培养基中，过夜培养后，使用无内毒素大提试剂盒提取质粒DNA，测得质粒DNA浓度均接近于1 μg/μL，260/280比值范围在1.98～2.00之间。

4 转染 293T细胞于转染前一天铺种，K562细胞转染当天处理，细胞均接种于24孔细胞培养板中。显微镜下观察细胞的状态和密度，选择生长状态良好、密度在70%～80%的细胞用于转染。以单个孔为例，取1 μg待转染质粒加入至25 μL的Xfect反应缓冲液中，振荡混匀5秒后向其中加入0.3 μL的Xfect聚合物，振荡混匀10 s。室温孵育10 min后，将混合物加入至待转染细胞中，轻轻混匀后置于37℃，5%CO2培养箱，4 h后更换新鲜培养基。

5 慢病毒包装与滴度检测 使用慢病毒二代包装系统（三质粒包装系统），目的质粒为lentiCRISPRv2-sgRNA4，慢病毒的结构蛋白编码质粒为psPAX2，蛋白外壳编码质粒为pMD2.G。前一天将293T细胞接种于10 cm细胞培养皿中，当细胞密度接近70%～80%时，使用Xfect转染试剂介导三质粒共转染，质粒质量比例为lentiCRISPRv2∶psPAX2∶pMD2.G=12∶6∶3。转染72 h后，收集病毒上清，用0.45 μm滤膜过滤后，25 000 r/min，4℃离心2 h得到病毒沉淀，用适宜体积的RPMI 1640培养基重悬病毒。使用慢病毒滴度检测卡估测病毒滴度，分装后保存于-80℃冰箱。

6 慢病毒感染K562细胞 预先摸索K562细胞嘌呤霉素的耐药性。调节细胞密度为5×105/mL，嘌呤霉素浓度梯度按照0、0.5、0.75、1、1.5、2 μg/mL加入细胞培养基中，每两天更换相应浓度的新鲜培养基。镜下观察发现，K562细胞经嘌呤霉素处理7天全部死亡的最低浓度为1 μg/mL。

取对数生长期的K562细胞制成细胞悬液，调节细胞密度为5×105/mL，根据感染复数（multiplicity of infection，MOI）值为20倍加入慢病毒，同时加入polybrene（终浓度8 μg/mL）促进细胞感染，混匀后将细胞铺种于12孔细胞培养板中，室温900×g离心30 min，培养48 h后加入嘌呤霉素（终浓度1 μg/mL）筛选带有抗性的细胞，并在后续培养过程中持续加入同浓度的嘌呤霉素。

7 PCR扩增及检测 目的细胞严格按照说明书提取基因组DNA。通过PCR反应扩增SMIM1基因3号和4号外显子的目的序列。PCR反应体系为50 μL，包括0.5 μL酶（5 U/μL）、5 μL缓冲液（10×）、8 μL dNTP（2.5 mM）、0.8 μM扩增引物、100 ng基因组DNA、双蒸水补足体积。PCR反应程序为：94℃预变性5 min，94℃ 40 s，64℃ 50 s，72℃ 30 s共30个循环，后置72℃延伸7 min。将扩增产物委托华大基因进行Sanger测序并送至苏州金唯智生物科技有限公司进行TA克隆检测，扩增引物序列[3，4，9]见表2，测序引物同正向扩增引物。

表2 SMIM1基因3号和4号外显子扩增引物序列

8 数据分析 流式检测分析转染效率采用FlowJo V10软件；实验数据的统计方法为t检验，绘图使用GraphPad Prism 7软件；序列分析采用SnapGene软件，测序结果与SMIM1基因参考序列（NG_033869）进行比对。

结 果

1 sgRNA初筛平台细胞系的选择 本研究选择贴壁生长的人胚肾293T细胞，通过Xfect试剂分别向K562和293T细胞中转入等量的表达GFP的质粒，转染48小时后收集细胞，通过流式分析仪检测细胞中GFP的表达情况。结果显示（图2），293T细胞组中GFP的阳性率明显高于K562细胞组，故后续将使用293T细胞用以筛选具有高效切割效率的sgRNA。

图2 转染后不同细胞系的GFP表达（n=3，**P＜0.01）

2 sgRNA筛选质粒的转染 将等量的5个sgRNA筛选质粒分别转入293T细胞中，转染48小时后收集细胞进行流式检测。结果显示（图3），转染组与未处理组相比，转染组均能检测到GFP的表达，说明Cas9-sgRNA共表达的筛选质粒成功转入293T细胞中，为敲除目的基因提供编辑元件。

图3 293T细胞转入sgRNA筛选质粒后GFP的表达

3 具有高效切割效率sgRNA序列的筛选 基于CRISPR/Cas9技术的工作原理，Cas9蛋白将在sgRNA识别位点处切割双链DNA产生碱基的插入缺失（Insertion-deletion，Indel）。将转染48小时后的细胞提取基因组DNA，经PCR扩增目的片段后进行Sanger测序，各测一个反应，测序结果通过Synthego网站（https：//ice.synthego.com）分析编辑效率（Indel%）（表3）。

表3 sgRNAs的编辑效率

结果表明，在相似转染效率的情况下，不同sgRNA序列的切割效率存在差异，因此需要建立一个有效的筛选平台以选择高效的sgRNA序列，以降低时间和费用成本。

4 敲除SMIM1基因K562细胞池的建立 本研究选择编辑效率最高的sgRNA4序列包装慢病毒后递送至K562细胞中，感染48小时后加入嘌呤霉素药物筛选，1周后收集1×106个细胞提取基因组DNA，经PCR扩增目的片段后进行Sanger测序。

如图4A所示，与野生型K562细胞相比，感染组在sgRNA4识别位点下游显示套峰，提示在该识别位点下游基因组序列存在差异。通过Synthego网站分析编辑效率（Indel%）为91%，说明通过慢病毒介导和药物筛选的方法可以有效提高目的基因的编辑效率。由于SMIM1基因由3号和4号外显子编码功能蛋白，为检测是否存在脱靶现象，同时对4号外显子进行Sanger测序。与野生型基因相比，编辑后细胞SMIM1基因的4号外显子碱基序列未发生改变（图4B）。

图4 慢病毒感染后K562-sgRNA4细胞池的Sanger测序峰图

5 TA克隆检测基因突变 由于利用CRISPR/Cas9技术在sgRNA识别位点敲除基因后产生的Indel是随机的，因而在上述细胞池中编辑后的基因型是不同的。为此我们将上述PCR产物进行TA克隆，挑取5个克隆测序均显示在sgRNA4识别位点附近发生突变。其中2号克隆和4号克隆两个等位基因分别缺失2个碱基和增添1个碱基，突变导致终止密码子提前，预期将影响编码Vel抗原（图5）。后续可以通过有限稀释等方法获得SMIM1基因敲除的单克隆K562细胞株。

图5 sgRNA4识别位点附近的基因突变鉴定

综合上述结果，本研究说明经筛选平台初筛的sgRNA序列，包装慢病毒介导CRISPR/Cas9系统能够成功编辑K562细胞的SMIM1基因。

讨 论

通过改造血型抗原的表达提高红细胞的输血相容性并不是全新的概念。早有学者尝试使用糖苷酶遮蔽抗原以转换ABO血型[10]。近年来，研究者们利用慢病毒载体介导的shRNAs降低造血干细胞中血型抗原的表达，在常规的红细胞凝集实验中，修饰后的细胞与相应抗原表型阴性的细胞表现出相同的反应现象[11]。但由于是不完全的敲除，残留的抗原可能仍会引起同种抗体的产生，并且造血干细胞的扩增能力有限，需不断转导shRNA以获得一定数量的修饰细胞。随着基因编辑技术的发展，国外有学者[12]利用TALENs（transcription activator-like effector nucleases）技术在RhD阳性的红系前体细胞中敲除RHD基因，将RhD阳性细胞转换为RhD阴性细胞，避免了重复转导编辑元件的弊端。但是TALENs技术依赖于蛋白对DNA序列的识别，如果靶向不同的DNA序列，就需要重新构建蛋白模块，工作量大且操作复杂。而CRISPR/Cas9技术依赖于碱基间的识别，只需要改动20 bp的sgRNA序列，就可以靶向不同的基因位点。Cas9切割双链DNA后，会促使细胞发生非同源末端连接的DNA修复机制，在断裂缺口引入的突变会改变该基因的读码框，从而导致基因的敲除[13]，该技术操作步骤简便且具有更高的编辑效率。

本研究使用的K562细胞为悬浮生长状态，不易与转染复合物结合，较难通过脂质体转染的方式转入基因编辑元件[14]，但是靶向同一基因不同位点sgRNA序列的切割效率存在差异。因此，本研究利用易转染的293T细胞初步筛选具有高效切割效率的sgRNA，简化操作步骤且降低实验成本。之后利用慢病毒介导将筛选后的Cas9-sgRNA编辑元件递送至K562细胞中，经Sanger测序和TA克隆检测，显示编辑后的细胞在sgRNA4识别位点处发生移码突变导致终止密码子提前，突变位点（如图5中sgRNA4-4）较目前已知的Vel（-）个体缺失17bp碱基的突变位点更靠近起始密码子，预期将提前终止翻译产生Vel（-）的表型。

本研究还存在不足之处有待进一步研究。一方面，仅在基因水平验证了该方法可以敲除K562细胞中的SMIM1基因。由于目前作者缺乏人源抗-Vel血清和商业化的流式抗体，难以在蛋白水平进行Vel抗原表达的鉴定。后续将通过有限稀释等方法建立单克隆细胞株，并尝试寻找合适的抗体在蛋白水平检测编辑后细胞的Vel抗原表型。另一方面，虽然K562细胞易于被诱导向红系定向分化，细胞表面表达红系特征的血型抗原[15]，但是其表面各种血型抗原的表达水平与红细胞相比仍然存在差异，并且K562细胞作为肿瘤细胞也限制了其定向改造，因此需要寻找更接近红细胞特性的永生化细胞系用于细胞模型的建立。

实际上，利用基因编辑技术改造血型抗原表型还存在更多可能。稀有血型常见于单个核苷酸突变（single nucleotide polymorphism，SNP），CRISPR/Cas9技术虽然可以实现基因敲除和定点修饰，但是基于同源重组机制的定点突变效率仍然偏低。近年来单碱基编辑技术发展迅速，该技术可以在不产生双链DNA断裂的情况下，将胞嘧啶转换为胸腺嘧啶（C＞T）或将腺嘌呤转换为鸟嘌呤（A＞G）[16-17]。相较于CRISPR介导的基因编辑，这一技术能够精准实现碱基的直接转换，大大提高了精确编辑基因的效率，有望应用于因SNP产生的稀有表型的血型抗原细胞模型的建立。

综上，本研究通过sgRNA初筛平台筛选靶向SMIM1基因3号外显子的高效sgRNA序列，利用慢病毒方法递送Cas9-sgRNA元件至K562细胞中，经Sanger测序和TA克隆检测，证实了该方法在K562细胞中敲除SMIM1基因的可行性。后续在此基础上可以构建Vel表型阴性的细胞模型并开展对Vel血型抗原的功能研究，也可以尝试制备该抗原表型阴性的细胞应用于抗体鉴定试剂细胞的生产，为满足Vel（-）稀有血型患者的输血需求提供更多可能。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突