时间:2024-12-22
徐元宏
临床微生物检验技术若干进展
徐元宏
临床微生物 检验技术 进展
临床微生物学是研究微生物的形态、结构、分类、生命活动规律的一门科学,包括细菌学、病毒学、真菌学等。新现与再现传染病的爆发促进临床微生物检验的发展,分子生物学技术日新月异丰富了临床微生物检验技术的内涵,现就近年临床微生物检验技术的进展作一综述。
虽然对“快速”的时间长短没有正式的定义,但是大多数人期望快速的系统能在4 h内提供可用的结果。微生物的繁殖时间是30 min或更长时间,不允许那些依赖微生物生长与否的检测方法。为了克服这一问题,必然使用全新的底物,检测待测菌产生的酶或蛋白质,从而在1~4 h内检测出应答反应。
1.1 细菌与真菌的快速诊断 经典临床微生物尤其细菌、真菌鉴定是根据培养基中的反应和物理特性的观察,如菌落形态和气味,再加上革兰染色、生化反应、凝集试验。常规使用的鉴定方法趋于微型化和便捷化。生化反应是依据每种生物对于系统中每种底物的反应来确定的,包括接种物制备、接种浓度、孵育条件和结果解释。大多数系统依赖于一个或几个指标的组合,包括:①底物利用后产生的pH值变化(API、Crystal、Vitek、MicroScan传统板、Phoenix板,Sensititre板);②酶促反应释放显色或荧光化合物(Crystal,Vitek,MicroScan快速试剂,Phoenix,Sensititre);③在各种碳源的存在时,四氮唑指示剂的代谢活性(Biolog);④挥发性或非挥发化合物的检测(MIDI);⑤可见生长的识别(API 20C AUX)。
MALDI-TOF MS比较的是菌株蛋白质指纹图谱,提供了快速且廉价的细菌和真菌鉴定方法[1]。MALDITOF MS系统主要包括生物梅里埃公司和BD布鲁克公司,Richter等进行了一项多中心的比较研究。他们比较了VITEK MS 与16S rRNA基因测序对17个属40个种的965株肠杆菌科细菌的鉴定结果[2],MALDI-TOF MS结果与菌株参考方法测出的结果相比,一致性达96.7%,其中83.8%正确鉴定至种水平,限于属水平鉴定率为12.8%,无法鉴定的占1.7%。MALDI-TOF MS可以鉴定Campylobacter species,Arcobacter butzleri,小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)和Aeromonas species,并区分犬咬二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga canimorsus)和Capnocytophaga cynodegmi[3]。可以鉴定Burkholderia cepacia复合群,包括Burkholderia cenocepacia,Burkholderia cepacia,Burkholderia stabilis和Burkholderia vietnamiensis[4]。HACEK菌群(Haemophilus,Actinobacillus/Aggregatibacter,Cardiobacterium,Eikenella,Kingella)和Legionella species 能够被鉴定出来。Francisella tularensis和Brucella species也有可能准确鉴定出来。
MALDI-TOF MS对葡萄球菌(Staphylococci)、β-溶血性链球菌(β-hemolytic streptococci)、气球菌(Aerococci)和肠球菌(Enterococci)的整体鉴定性能都是极佳的。而对一些α-溶血性链球菌(α-hemolytic streptococci)有困难。质谱系统可靠鉴定溶血隐秘杆菌(Arcanobacterium haemolyticum)和马红球菌(Rhodococcus equi),除密切相关的外,所有棒杆菌属菌也可准确鉴定[5]。
MALDI-TOF MS技术可用于鉴定许多临床相关的厌氧菌。Jamal等[6]报道使用布鲁克和生物梅里埃对274株常规分离厌氧菌的鉴定准确率分别为89%和100%。针对更难鉴定的厌氧菌包括普雷沃菌属,可成功鉴定83%的菌株。Schmitt等评估了布鲁克系统对广泛收集的253种临床厌氧菌的鉴定效果,其在属和种的水平上的正确鉴定率分别为92%和71%[7]。Barreau等利用布鲁克系统在种的水平正确鉴定了1 325株厌氧菌中的92.5%的菌株[8]。Garneret等评估了采用VITEK MS 对651株厌氧菌的鉴定结果,并报道鉴定到种水平的正确率为91.2%[9]。
MALDITOF MS应该能够鉴定大多数临床相关的分枝杆菌菌种,结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex)或许只能鉴定到复合群水平,其它一些种(例如Mycobacterium abscessus和Mycobacterium massiliense; Mycobacterium mucogenicum和Mycobacterium phocaicum ;Mycobacterium chimaera和Mycobacterium intracellulare)彼此难以很好地区分开来。诺卡菌属可以鉴定,但与分枝杆菌属一样,需要特殊的样本提取与处理过程。
MALDI-TOF MS在菌株同源性分析方面的研究取得可喜的进展,有研究显示[10-12]其对细菌同源性分析的准确度与PFGE高度一致。
MALDI-TOF MS可以鉴定酵母菌,且性能优于一些传统的表型鉴定系统。它可以鉴别都柏林假丝酵母菌(C. dubliniensis)和白假丝酵母菌(C.albicans);皱折假丝酵母菌(C.rugosa)和近邹褶假丝酵母菌(C.pararugosa);挪威假丝酵母菌(C.norvegensis)、克柔假丝酵母菌(C.krusei)和平常假丝酵母菌(C.inconspicua、);近平滑假丝酵母菌(C.parapsilosis)、 C.orthopsilosis 和C.metapsilosis;Dhiman等评估了布鲁克系统对138种常见和103种不常见酵母菌株的鉴定情况,该系统种水平的鉴定准确率分别可达96%和85%[13]。对于鉴定冷僻菌种如无名假丝酵母菌(C.famata)等,MALDI-TOF MS可能优于目前其它系统[14]。
丝状真菌的表型易变,其蛋白质谱可随生长条件及分析菌丝区域的不同而变化。De Carolis等人使用布鲁克Biotyper系统开发了曲霉菌(Aspergillus species)、镰刀菌(Fusarium species)和毛霉菌(Mucorales)的数据库,并用于94株菌的鉴定,其种水平的正确率高达97%[15]。 Iriart等人利用VITEK MS 成功鉴定了44株曲霉菌中的82%的菌[16]。随着数据库建立的不断完善,皮肤癣菌是可被鉴定的。初步研究表明,假霉样真菌(Pseudallescheria)/丝孢酵母属(Scedosporium)复合群可被鉴定。Lau等人使用一种特殊的真菌提取流程检测了421株霉菌,其种水平与属水平的鉴定准确率分别是88.9%和4.3%[17]。
2.1 DNA靶向测序 对于纯培养的微生物可以进行DNA序列的靶向测序。靶基因的保守区往往是PCR引物和DNA测序引物退火结合的区域。可变区具有独特的核苷酸序列,从而实现基于测序的特定菌株属和种的鉴定。鉴定细菌最常用的靶序列是16S rRNA基因(16S rDNA),它是一个约1 500 bp的基因,编码核糖体30S亚基的一部分。部分(500 bp)16S rRNA基因测序常用革兰阴性、革兰阳性细菌、厌氧菌与分枝杆菌的序列鉴定。对于部分16S rRNA基因序列高保守性的菌属,全长16S rRNA基因测序或其它靶DNA测序可能有助于鉴别鉴定。基于测序细菌鉴定的其它靶DNA序列包括rpoB基因(细菌RNA聚合酶β亚基)、tuf(延伸因子Tu)、gyrA或gyrB基因(促旋酶A或B)、sodA(含锰超氧化物歧化酶)和热休克蛋白基因等。虽然其它靶序列在种属分辨上比16S rRNA基因更好,但由于这些序列不够保守,可能需要属或群特异性的PCR或DNA测序引物,且其能够利用的序列数据比现有16S rRNA基因要少。鉴定酵母菌和医学相关霉菌的潜在靶序列包括Internal transcribed spacer regions ITS1和ITS2,它们作为可变区定位于编码18S、5.8S和28SrRNA的保守基因之间、及28S rRNA基因的D1-D2区。鉴定微生物用的DNA靶向测序结果与公开的(如GenBank)和/或私有的(如MicroSeq)数据库的参考序列进行比对。通过比较查询序列和参考序列,两者之间存在的非匹配核苷酸数量将用来确定两者的相关性,最终的结果报告为序列一致性百分比。在属或种的水平,鉴定微生物界定的可接受序列一致性百分比的数值是不同的,这取决于DNA靶序列及微生物本身的特性。多数细菌的16S rRNA基因为多拷贝靶基因,一个微生物的16S rRNA基因序列若有变异,可能产生难以解释的序列数据。临床及实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute)刊发了一份广泛认可的共识文件以指导DNA靶向测序技术在属和种的水平鉴定微生物;对即将或已经实施DNA靶向测序的实验室人员而言,这份文件是一份有用的指南手册[18]。未来全基因组测序在临床上将变得更为常规化,可为临床提供种多样性、毒力特性、流行病学、耐药机制及病因学信息。
2.2 电喷雾离子化质谱(ESI-MS)技术应用于PCR产物的分析 将电喷雾离子化质谱(ESI-MS)技术应用于PCR产物的分析,可以实现基于PCR技术的细菌鉴定,发挥这一功能的质谱称之为PCR电喷雾离子化质谱(PCR/ ESI-MS)。它检测的是经PCR扩增后的广谱基因(例如rRNA)和特定基因的质量,而非细菌蛋白质的质量。电喷雾离子化质谱的检测精度能够确保通过检测扩增DNA的质量,精确地计算出扩增DNA的核苷酸组分。通常,PCR反应的检测与分析都是成组地批量进行的。通过分析哪个PCR反应能够给出扩增产物,并结合其核苷酸组分信息,就可能对待检微生物做出鉴定。该方法在概念上与广谱PCR扩增后进行测序的鉴定方法非常类似;但不同之处在于,质谱提供的是,核苷酸序列未知情况下,碱基(构成)组分信息。通过分析微生物基因组的多个靶位点,可以弥补与核苷酸序列相比核苷酸组分提供的信息量偏低的不足。Simneret等近期评价了PLEX-ID广谱真菌检测试验(Abbott,Abbott Park,IL)对91株特定真菌的鉴定效果,属与种水平的鉴定准确率分别为95.6%和81.3%[19]。相比测序法,PCR/ESI-MS的优势是快速和高通量。
2.3 复合感染病原体的快速诊断 在一个或多个体系扩增通用保守序列或特异性片段,扩增产物通过偶联在荧光微球体或固相芯片上的通用序列(抗标签)进行分拣。这些数据随后通过分析软件进行分析以检测的各类病原体/亚型是否存在,即目前所谓的PCR-液相芯片/固相芯片杂交技术。市场已见产品有Luminex xMAP和bioMérieux FilmArray。一次可以检测多个病原体(细菌、真菌、病毒与寄生虫);也可以检测不同类别的感染标本(血液、呼吸道分泌物、粪便与脑脊液)。
3.1 G试验、GM试验、隐球菌荚膜多糖抗原 由于广谱抗生素的使用、侵袭性操作、肿瘤放化疗及老年患者免疫功能的下降,导致侵袭性真菌感染不断增加,真菌形态学及鉴定(生化反应)困难,有关侵袭性真菌感染需要开展G试验、GM试验、隐球菌荚膜多糖抗原检测。可以达到快速诊断侵袭性真菌感染并区分其感染的病原体。
3.2 内毒素与外毒素 内毒素和外毒素是细菌产生的两大类毒素物质。内毒素是革兰阴性细菌细胞壁的组成成分,它是磷酸一多糖一蛋白质的复合物。外毒素是病原菌在代谢过程中分泌到菌体外的物质。产生外毒素的细菌主要是一些革兰阳性细菌,少数革兰阴性菌如霍乱弧菌和产毒性大肠杆菌等也能产生外毒素。目前临床微生物检验能够开展的是内毒素,难辨梭状芽胞杆菌A、B毒素,幽门螺杆菌尿素酶、细胞毒素相关基因CagA和空泡毒素VacA的检测。
难辨梭状芽胞杆菌是一种能形成芽胞的革兰阳性厌氧杆菌,伪膜性肠炎的病原体。大便厌氧培养对难辨梭状芽孢杆菌检出率较低,靠培养方法来诊断难辨梭状芽孢杆菌相关性腹泻(CDAD)很困难。确诊CDAD通常需要采用组织培养法(CCNA)。CCNA可以检测出低至1 pg的毒素,被公认为是检测难辨梭菌毒素的金标准,但是CCNA费时且复杂,故在临床实施困难。目前检测大便CD毒素A、B则成为快速诊断CDAD的主要手段。幽门螺杆菌是慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤和胃癌的主要致病因素,其菌体抗体检测有其局限性,其致病性物质有尿素酶、细胞毒素相关基因CagA和空泡毒素VacA。
3.3 病原体IgM 病原体感染刺激机体产生早期IgM和恢复期IgG,IgM对于快速的早期感染诊断具有一定价值,目前检测包括嗜肺军团菌(LP)、肺炎支原体(MP)、Q热立克次体(COX)、肺炎衣原体(CP)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒(IFA)、乙型流感病毒(IFB)、副流感病毒1、2和3型(PIVS)。
3.4 超敏C反应蛋白、炎症细胞因子、PCT C反应蛋白是由肝脏合成的一种全身性炎症反应急性期的非特异性标志物,是心血管事件危险最强有力的预测因子之一。超敏C反应蛋白能准确的检测低浓度C反应蛋白,提高了试验的灵敏度和准确度,是区分低水平炎症状态的灵敏指标,血清hs-CRP 水平与动脉粥样硬化及急性脑梗死( ACI) 的发生、严重程度及预后密切相关 。
炎症细胞因子是指参与炎症反应的各种细胞因子。起主要作用的是TNF-α 、IL-1β、IL-6、IL-8等。TNF-α是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质,能激活中性粒细胞和淋巴细胞,使血管内皮细胞通透性增加,调节其他组织代谢活性并促使其他细胞因子的合成和释放。IL一6能诱导B细胞分化和产生抗体,并诱导T细胞活化增殖、分化,参与机体的免疫应答,是炎性反应的促发剂。IL-8能刺激中性粒细胞、T淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的趋化,促进中性粒细胞脱颗粒,释放弹性蛋白酶,损伤内皮细胞,使微循环血流淤滞,组织坏死,造成器官功能损伤。
降钙素原(PCT)是无激素活性的降钙素前肽物质,PCT主要是在细菌毒素和炎性细胞因子的诱导刺激下产生,病毒感染或自身免疫病时水平很低;血清PCT水平高低还反映疾病的严重状态,也是判断预后和评价疗效的良好指标,是脓毒症的诊断、预后及治疗监测的评估指标。上述三者联合检测有助于感染类型的甄别。
3.5 病原体快速药敏试验 经典的药敏试验有K-B纸片扩散法、微量液体稀释法和E-test,孵育18~24 h判读结果,不能满足临床需要。dRAST通过微孔和微流控板,将细菌数量通过成像技术显示,常规细菌4 h、结核分枝杆菌1周报告报告药敏结果。
临床微生物检验采用成熟的技术为患者服务,性能稳定、结果可靠,分子生物学技术应用于临床微生物检验需要分选。作为临床微生物检验工作者,既要守住形态学基本功,又要掌握分子生物学前沿技术应用于临床微生物检验,拓展微生物与感染、抗生素与耐药、致病性等相关知识,更好为人类健康服务。
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R446.5
A
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2016-05-25)
(本文编辑:姚萍)
10.3969/j.issn.1671-2587.2017.01.030
230061 安徽医科大学第一附属医院检验科
徐元宏(1964–),男,安徽无为人,主任技师,硕士,主要从事临床微生物研究,(E-mail)xyhong1964@163.com。
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