粟酒裂殖酵母中Hsp60蛋白定位与表达水平的研究

王子璇,商巾杰

(南京师范大学生命科学学院,江苏 南京 210023)

蛋白质的组装被认为是多肽一级序列本身固有特性的唯一结果. 然而,在某些情况下,需要来自其他蛋白质分子的结构信息才能正确折叠并随后组装成寡聚物[1]. 这些“辅助”分子被称为分子伴侣,其中一个亚家族是伴侣蛋白[2],包括10 kDa和60 kDa蛋白质. 分子伴侣在原核生物、叶绿体和线粒体中大量存在,为正常细胞生长所必需,且是应激诱导的,在热休克条件下起到稳定或保护分解多肽的作用. 其中,Hsp60属于一类60-65 kDa的分子伴侣,是由14-18个亚基组成的双圆环形状蛋白结构[3-4]. 一般来说,细胞中通过转录、翻译后产生的多肽通过与Hsp10复合体相互作用,在Hsp60复合体的空腔中折叠成正确的蛋白结构,这一过程需要ATP的参与[5].

Hsp60属Ⅰ类分子伴侣,又被称为HSPD1或Cpn60,存在于线粒体中维持其蛋白质稳态. 其在健康和疾病中发挥着多重作用,尤其是作为一系列获得性和遗传性疾病的致病因子[6-8]. 因其有望给分子伴侣疾病的诊断和治疗方法带来新的发展,如各类癌症、炎症、自身免疫性疾病及一系列神经退行性疾病[8-11],Hsp60抑制剂和调节剂可能会作为新型抗癌药物发挥功能[12],近年来国内外学者对Hsp60的研究兴趣一直在稳步增长.

粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)作为模式生物,为分析高等真核生物的基因结构和功能提供了极好的模型系统. 相较于另一种模式生物——芽殖酵母(Saccharomycescerevisiae),裂殖酵母细胞中热休克蛋白的转录调控与哺乳动物细胞中的转录调控模式更为相似[13]. 目前对裂殖酵母中热休克蛋白的研究还不多. 本文对粟酒裂殖酵母中Hsp60蛋白进行了研究,经生物信息学分析研究发现,Hsp60定位于线粒体基质. Hsp60蛋白水平在高温刺激时显著增加,而生长时间对其蛋白表达无影响,这也为今后利用Hsp60作为线粒体蛋白表达的参照物提供了理论基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株与培养基

粟酒裂殖酵母yHL6381(h+leu1-32his3-D1ura4-D18ade6-M210),由南京师范大学微生物所实验室保存,培养基为YES(100 mL):3 g葡萄糖,0.5 g酵母粉,20 mg Adenine,20 mgL-histidine,20 mgL-leucine,20 mg Uracil.

1.1.2 实验试剂

酵母粉购自OXOID;Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum购自Sigma-Aldrich;Western Blot 中使用的抗体购自金斯瑞生物科技股份有限公司;其他常用试剂购自南京丁贝生物科技有限公司.

S buffer:sorbitol 25.48 g,HEPES 0.9532 g,1 mol/L MgCl250 μL. 加80 mL超纯水完全溶解,用KOH调节pH至6.5,用双蒸水溶解至100 mL,4 ℃保存.

匀浆buffer:2 mol/L山梨醇 30.0 mL,1 mol/L Tris-HCl(pH 7.5)1.0 mL,0.1 mol/L EDTA 1.0 mL,10 mmol/L PMSF 1.0 mL,用双蒸水溶解至100 mL.

SEM buffer:100 mmol/L MOPS(pH 7.2)10.0 mL,2.5 mol/L 蔗糖10.0 mL,0.1 mol/L EDTA 1.0 mL,用双蒸水溶解至100 mL.

Extraction buffer:0.1 mol/L Na2CO3,1 mmol/L PMSF,1 μg/mL pepstatin,用NaOH调pH至11.5.

Solubilization solution:2% SDS,0.8% β-巯基乙醇,20% 甘油,50 mmol/L Tris-HCl(pH 6.8),0.02%溴酚蓝.

1.2 实验方法

1.2.1 线粒体的粗提取

取YES固体培养基上的酵母菌,接入5 mL YES中,30 ℃,200 r/min振荡培养12 h. 将培养的母液转接至200 mL YES液体培养基中,调节起始OD600=0.2,30 ℃与37 ℃,200 r/min振荡培养12 h,收菌. 用超纯水和S buffer各清洗一遍菌体,离心收菌. 用S buffer重悬菌体,称重菌体,加入菌体质量4倍的S buffer和1/10倍溶壁酶Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum,37 ℃ 200 r/min 孵育2～4 h,用显微镜观察裂解情况,裂解至80%以上的酵母变圆后离心收菌,加入菌体4倍体积的预冷的匀浆buffer吹打混匀,将菌液转移至Dounce组织匀浆器中,冰上研磨15-20次. 4 ℃ 4 000 r/min离心5 min,取上清液. 4 ℃ 5 000 r/min离心5 min,取上清液,重复一次. 4 ℃ 12 000 r/min离心5 min,弃上清液. 加5 mL SEM buffer,置于冰上吹打混匀. 4 ℃ 12 000 r/min离心15 min,弃上清液. 沉淀为粗线粒体. 加1 mL SEM buffer,重悬沉淀,-80 ℃保存.

1.2.2 分离线粒体基质蛋白与膜蛋白

取1.2.1中提取的粗线粒体,4 ℃ 12 000 r/min离心15 min,弃上清液. 加入预冷的Extraction buffer重悬线粒体,冰浴30 min,每10 min混匀一次. 冰浴结束后超速离心,4 ℃ 100 000 g离心1 h. 取上清液,4 ℃ 100 000 g再次超速离心1 h. 取上清液,加入等体积20%三氯乙酸溶液,冰上沉降15 min. 4 ℃ 12 000 r/min 离心15 min,弃上清液,用1 mL预冷的丙酮重悬沉淀. 4 ℃ 12 000 r/min离心15 min,弃上清液,于室温挥发丙酮. 加入Solubilization solution重悬沉淀,此时样品为可溶性蛋白和与膜结合力弱的蛋白(S). 取第一次超速离心的沉淀,加入预冷的Extraction buffer重悬,4 ℃ 100 000 g超速离心1 h,弃上清液. 加入Solubilization solution重悬沉淀,此时样品为疏水性膜蛋白(P). 蛋白样品煮沸后可用于Western Blot检测,或-80 ℃保存.

1.2.3 Western Blot 检测蛋白水平

取粗线粒体样品,加入5×Protein Loading buffer后100 ℃煮沸10 min,上样于12%聚丙酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳. 300 mA,90 min转膜. Blocking buffer(0.137 mol/L NaCl,0.02 mol/L Tris,5%脱脂奶粉)封闭NC膜1.5 h. TBST(0.02 mol/L Tris,0.137 mol/L NaCl,0.1% Tween 20,调pH至7.4)振荡清洗,加入一抗,4 ℃ 12 h或常温2 h孵育,TBST清洗后,加入二抗,避光孵育1 h,ODYSSEY扫描显示结果.

2 结果与讨论

2.1 Hsp60蛋白结构分析

使用MitoProt II软件预测Hsp60的线粒体定位序列(mitochondria targeting sequence,MTS),显示其定位于线粒体信号肽为N端前33个氨基酸,具体序列为MVSFLSSSVSRLPLRIAGRRIPGRFAVPQVRTY,其中包含6个碱性氨基酸和6个羟基氨基酸残基,但没有酸性氨基酸残基. 在Pfam数据库中,Hsp60蛋白存在一个Chaperonin Cpn60/TCP-1 family结构域,其位置为第54到第558个氨基酸,如图1所示.

MTS:线粒体定位序列图1 Hsp60蛋白特征Fig.1 Protein features of Hsp60

使用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org)对Hsp60蛋白质结构进行同源建模,蛋白三维结构模型的模板为HomosapiensHSPD1(SMTL id 4pj1.1),序列相似度为56.90%. Hsp60二级结构主要由α螺旋(紫色)与β折叠(绿色)构成,模型显示了一种“美式足球”型中间物,有14个亚基,由两个7亚基的分子伴侣环组成,如图2所示.

紫色显示α螺旋结构;绿色显示β折叠结构图2 Hsp60蛋白三维结构Fig.2 3D structure of Hsp60

2.2 生物信息学分析

本研究通过NCBI数据库分析发现了芽殖酵母(Saccharomycescerevisiae)与人类(Homosapiens)的Hsp60的同源基因,并对其蛋白序列进行了生物信息学比对,如图3所示. 可以发现,在蛋白中段属于 Chaperonin Cpn60/TCP-1 family结构域中有大量相同序列与保守序列(黄色、蓝色),而N端的线粒体定位序列部分有较大差异. 其中,Hsp60与人和芽殖酵母分别有56%或67%的同源性和71%或79%的同源性. 本研究在117—122位氨基酸序列中发现了一个高度保守的ATP结合位点(GDGTTT/S),且在C端发现了一个富含Gly+Met的模体.

2.3 Hsp60蛋白定位

为了证实Hsp60的线粒体定位,首先通过粗提线粒体方法,用Hsp60自身抗体检测其在不同细胞组分中的表达量. 检测发现,在线粒体(M)和全细胞蛋白(T)中可检测得到Hsp60,除线粒体以外的部分(PMS)Hsp60信号极弱,说明Hsp60定位于线粒体而不是细胞质或其他组分,如图4(a)所示.

黄色表示相同序列;绿色表示微弱相似度序列;蓝色表示保守序列图3 Hsp60同源蛋白序列比对Fig.3 Protein sequence alignment of Hsp60 homologous

T:全细胞;PMS:上清;M:粗提线粒体;S:上清;P:沉淀图4 Hsp60定位于线粒体Fig.4 Hsp60 locates in the mitochondria

为进一步探究Hsp60在线粒体中的定位,使用Na2CO3处理粗提线粒体. 使用Na2CO3处理线粒体后,线粒体膜会破碎,释放出基质蛋白,通过离心方法,即可分离线粒体基质蛋白与膜蛋白. 若蛋白信号在上清(S)中能够检测得到,则说明蛋白质定位于线粒体基质;若蛋白信号在沉淀(P)中能够检测得到,则说明蛋白质定位于线粒体膜上. 检测结果如图4(b)所示,只有在粗提线粒体(M)和上清(S)中可检测到Hsp60蛋白信号,说明Hsp60定位于线粒体基质而不是线粒体膜上.

2.4 不同生长条件下Hsp60蛋白表达量研究

本文检测了野生型细胞在30 ℃和37 ℃条件下Hsp60蛋白水平,以及生长对数期和稳定期的蛋白水平,如图5所示. 细胞在30 ℃和37 ℃培养12 h后,提取线粒体,检测其Hsp60、Cox4蛋白的表达量,其中Cox4作为对照内参. 可以发现,Hsp60蛋白水平在37 ℃条件下显著增加(见图5(a)). 本文还检测了细胞在正常生长条件下的Hsp60蛋白水平. 细胞在30 ℃培养12 h、60 h后,提取线粒体,检测其Hsp60、Cox4蛋白的表达量,其中Cox4作为对照内参. 可以发现,在生长对数期和稳定期Hsp60蛋白水平无明显变化(见图5(b)).

LP:对数期;SP:稳定期图5 不同生长条件下Hsp60蛋白表达量Fig.5 Hsp60 Protein expression at different temperatures

3 结论

本文经生物信息学研究分析,发现裂殖酵母Hsp60是一类高度保守的蛋白,其中部属于Chaperonin Cpn60/TCP-1 family结构域的氨基酸序列在人、芽殖酵母中都具有相似性. Chaperonin Cpn60/TCP-1 family结构域在原核生物、真核生物中都十分保守,其蛋白家族包含两种伴侣蛋白,一种为10 kDa伴侣蛋白(细菌中的Cpn10-或GroES),以6-8个相同亚基的环状寡聚物形式存在;另一种为60 kDa伴侣蛋白(细菌中的Cpn60-或GroES),由2个堆叠的环组成,每个环包含7个相同的亚基,Hsp60属于此类伴侣蛋白.

Hsp60在N端含有线粒体定位序列,由细胞核基因编码,在细胞质中合成后定位于线粒体的蛋白质. 芽殖酵母中的HSP60会定位于线粒体并在线粒体内正确加工为有功能的蛋白质[14]. 人类可以检测到HSPD1在细胞中定位于线粒体基质[15]. 除此之外,其定位还与细胞状态密切相关,如诱导细胞凋亡过程中HSPD1会在细胞质内积累[16]. 本文通过提取细胞线粒体及使用Na2CO3处理线粒体,通过Western Blot方法检测蛋白水平,发现Hsp60定位于线粒体基质.

Hsp60作为一个高度保守的热激蛋白,在不同的物种中已被广泛研究. 在芽殖酵母中,当细胞从25 ℃转移到39 ℃条件下培养时,Hsp60的mRNA水平会升高2～3倍[17]. 而在裂殖酵母中仅有文献报道,25 ℃培养的细胞转移到35 ℃培养条件下时,Hsp60的mRNA水平会瞬间升高,然后逐渐降低[18],而蛋白水平的变化还未知. 本文检测了不同条件下Hsp60的蛋白水平,发现Hsp60在37 ℃热激条件下,其蛋白表达量显著增加,之后会轻微降低,这与mRNA水平一致,说明Hsp60在高温刺激下蛋白表达水平上升,是一个定位于线粒体基质的热激蛋白.

本研究发现在使用Western Blot方法研究不同生长时期线粒体蛋白水平变化时,Hsp60蛋白表达量保持不变,因此可使用Hsp60与Cox4作为内参蛋白;由于Hsp60在热激条件下表达量会显著上升,在研究热激条件下线粒体蛋白水平变化时应使用Cox4作为内参蛋白,而不能使用Hsp60. 本研究表明,Hsp60可以为研究线粒体蛋白不同生长时期表达量水平提供良好的内参工具.