保健品中西地那非和他达拉非的拉曼光谱同时检测方法研究

司星宇，陈致，周千渝，陈卓，王红球，*

(1 北京鉴知技术有限公司，北京 100084; 2 北京微量化学研究所，北京 100091)

1 引言

抗疲劳类保健品是可能含有违禁药物的一类食品，每年涉及的食品安全刑事案件占比高，近五年涉及刑事案件2000余起，占到所有保健品相关案件的70%以上。抗疲劳类保健品中常见两种药物的非法添加——西地那非和他达拉非。西地那非和他达拉非都属于磷酸二酯酶5型抑制剂，分别是万艾可(又称伟哥，英文名Viagra®)和希爱力(英文名Cialis®)的主要活性药物成分。其药理作用是通过抑制cGMP 的代谢，促进海绵体动脉平滑肌舒张，进而改善勃起功能障碍症状。目前这两个药物是国家药品监督管理局批准上市的治疗男性性功能障碍的处方药药品，已知其主要副作用有面部潮红、头晕、头痛、鼻塞和视觉异常等，严重的会导致死亡[1,2]。当前，不法保健品商家为了提升其产品效果，经常在所谓抗疲劳类保健品中添加西地那非、他达拉非类药物成分，药物对消费者的健康构成危害。这类抗疲劳类保健品在各种非正规渠道有大量消费群体，潜在的社会影响巨大。公安和市场监督部门为了能够监管相关案件和产品，须采取必要措施对保健品中非法添加药物进行快速筛查。故建立保健食品中西地那非和他达拉非的检测方法意义重大。

长期以来，公安机关依赖专业的第三方检测实验室对涉案样本进行检测，其检测结果准确但是时间和经济成本均较高。检测实验室通常采用高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)进行保健品中西地那非、他达拉非的检测。如国家食药总局发布的食品补充检验方法BJS 201805《食品中那非类物质的测定》中，超高效液相-串联高分辨质谱方法西地那非检出限是2～5 mg/kg，他达拉非检出限是10～40 mg/kg[3]。HPLC-MS技术具有灵敏度高、重复性好的技术优点，是目前检测保健品中西地那非及其类似物的常用方法和标准方法。但是此技术检测时间较长，设备昂贵，单次检测成本高，且仪器操作复杂，需要专业的人员和有资质的实验室进行检测分析。目前，公安机关向第三方实验室往返送样周期在两周以上，如此长的检测周期难以实现保健品相关刑事案件的快速打击。随着各地公安对保健食品案件的重视程度不断增加，公安机关对保健品非法添加药物快速筛查技术的需求愈加迫切。

目前最为普及的西地那非和他达拉非快速检测方法是表面增强拉曼光谱法(SERS)，已经在市场监督和公安机构得到一定程度的推广[4-7]。一般操作流程是使用提取剂做简单的样品前处理，混合纳米增强试剂进行SERS检测。拉曼的指纹光谱特性决定其特异性高，避免了假阳性的产生，另外SERS放大了拉曼散射信号，检出限可达到mg/kg级别的灵敏检测。目前，SERS技术用于保健品中非法添加药物筛查还有一些局限性，一方面尚无法实现西地那非和他达拉非的同时检测，没有发挥出SERS多项筛查的优势。如果能够将两者合为同一检测流程那么将为使用者带来更多便利，另一方面对于添加量较低的样品，SERS的检测灵敏度与HPLC-MS方法相比还有一定差距。需要进一步降低方法检出限，以确保不发生漏检。

本文在已有研究基础上，建立了一种基于SERS的保健食品中西地那非和他达拉非的同时检测方法。该方法可同时对西地那非和他达拉非做多项筛查，检出限为西地那非5 mg/kg，他达拉非10 mg/kg，检出限水平与HPLC-MS方法相当。方法可测胶囊、片剂类大部分抗疲劳类保健品。本文所报道检测方法有助于SERS技术在公安等快检场景的进一步推广应用。

2 实验方法

2.1 试剂与仪器

除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。乙酸乙酯、二氯甲烷、异丙醇、甲醇、乙醇、丙酮为分析纯，购买自北京百灵威科技有限公司。西地那非和他达拉非纯度≥97%，购自上海麦克林生化科技有限公司，信息见表1。SERS测试用到的SA50纳米增强试剂和助剂购于北京鉴知技术有限公司。

表1 西地那非和他达拉非标准品信息Table.1 Basic information of sildenafil and tadalafil standards

实验所使用的便携式拉曼光谱仪为北京鉴知技术有限公司RS3000食品安全检测仪。稳频激光光源发射波长为785.01 nm，线宽<0.1 nm，能量≥350 mW，数据采集时间≥2 s；光谱分辨率≤8 cm-1；光谱响应范围50 cm-1～3200 cm-1。大龙移液器100 μL、1 mL和5 mL规格。涡旋振荡器lab dancer购买自德国IKA公司。离心机为恒诺可调迷你离心机，型号为ministar 10K，转速3000～10000 rpm。电子天平型号为西杰BSM224，感量为0.0001 g。

2.2 西地那非、他达拉非同时检测的样品前处理步骤

取200 μL液体样品或0.2 g固体样品于2 mL离心管中，加入1 mL乙酸乙酯，涡旋提取1 min，之后10000 rpm离心2 min，上清液待测；

取400 μL纳米增强试剂和20 μL待测液于测样小瓶中，再加入50 μL助剂，混匀放入RS3000样品仓测试。

整体检测时长约为10分钟。

2.3 结果判定

RS3000仪器软件将测试结果与标准谱图库中的西地那非或他达拉非进行匹配计算。根据谱图1582 cm-1(±10 cm-1)处特征拉曼光谱及内置校准曲线，对样品中的西地那非进行结果判定：显示测试结果并判定阴性或阳性。阴性代表该样品不含有西地那非或低于5.0 μg/g或5.0 μg/mL，阳性则代表该样品含有西地那非且大于等于5.0 μg/g或5.0 μg/mL。根据谱图794 cm-1(±10 cm-1)处特征拉曼光谱及内置校准曲线，对样品中的他达拉非进行结果判定：显示测试结果并判定阴性或阳性。阴性代表该样品不含有他达拉非或低于10.0 μg/g或10.0 μg/mL，阳性则代表该样品含有他达拉非且大于等于10.0 μg/g或10.0 μg/mL。

3 结果与讨论

3.1 西地那非和他达拉非同时检测的样品前处理步骤优化

西地那非的SERS响应比他达拉非强许多，因此检测方法的优化以他达拉非为主进行。对提取试剂进行了筛选，最终确定乙酸乙酯是最佳提取试剂。分别选用乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯甲烷-盐酸反萃取、异丙醇、甲醇、乙醇、丙酮等多种体系，对10 μg/g的他达拉非阴性加标样进行提取，并完成2.2的检测流程得到SERS谱图(图1)。他达拉非主要特征峰峰位如下：574 cm-1、794 cm-1、916 cm-1、986 cm-1、1232 cm-1、1360 cm-1、1478 cm-1、1556 cm-1等。结果显示仅有乙酸乙酯的萃取体系才可以较好的得到他达拉非的8个特征峰，而其他体系均得到一些干扰峰。这一结果证明乙酸乙酯可以较为特异性的提取他达拉非，而不会引入过多干扰物影响后续SERS检测。

图1 选用不同提取剂对他达拉非阴性加标样品做萃取的最终检测结果Fig. 1 The Raman spctrum of tadalafil spiked samples using different extraction soluitons

对前处理过程中的样品取样量做了优化，证明是使用0.2 mL样本量为最佳值。分别取样0.1、0.2、0.5 mL他达拉非阴性加标样品完成2.2的检测流程，得到SERS谱图(图2)。当取样量为0.2 mL时794、986 cm-1等处的特征峰更为明显，故选用0.2 mL为最佳取样量。分析其原因，当样本量过大时，会给整个检测体系引入过多杂质影响。而样本量过小则会导致他达拉非提取浓度过低。

图2 改变阴性加标样品的取样量进行样品前处理和检测的检测结果Fig. 2 The Raman spctrum of tadalafil spiked samples with different sampling amount

3.2 西地那非与他达拉非同时检测的检出限

选用阴性加标样品测试西地那非和他达拉非的检出限，最终结果西地那非检出限为5.0 μg/g，他达拉非检出限为10.0 μg/g。选用一种确认不含有西地那非和他达拉非的阴性保健酒样品，加标不同浓度的检测结果如图3所示。与他达拉非不同，西地那非主要特征峰峰位有648 cm-1、814 cm-1、1236 cm-1、1398 cm-1、1528 cm-1、1582 cm-1等，在阴性加标样中主要是1528 cm-1、1582 cm-1两个峰比较明显。从这两个峰来看，在5 μg/g

图3 在阴性加标样品中添加不同浓度的西地那非和他达拉非后得到的SERS谱图Fig. 3 The Raman spctrum of spiked samples with different concentrations of sildenafil and tadalafil

及以上浓度的加标样品中，1528 cm-1、1582 cm-1的SERS信号很明显，达到了三倍S/N，空白样品和2 μg/g加标样品中峰不明显，故确定样品中西地那非检出限为5 μg/g。而他达拉非主要是574 cm-1、794 cm-1、986 cm-1、1360 cm-1几个峰较为明显。在10 μg/g及以上浓度的加标样品中四个峰的信号很明显，达到了三倍S/N，空白样品的5 μg/g加标样品中峰不明显，故确定样品中他达拉非检出限为5 μg/g。在同时添加了5 μg/g西地那非和10 μg/g他达拉非的阴性加标样品中，最终得到的SERS谱图能同时看到两者的特征峰，互相没有干扰，证明方法可以同时对西地那非和他达拉非进行检测。

3.3 对实际样品中的西地那非及他达拉非进行同时检测

本文开发的方法可以对诸多类型的实际样品进行检测，且可以对西地那非和他达拉非做同时筛查。从网络平台购买了两款抗疲劳类保健品，并使用本文所建立的方法对两个样品进行检测，发现其中之一非法添加了他达拉非。所购买的两款保健品一种为棕色片剂，另一种为绿色胶囊制剂。用2.2的检测流程对两个样品进行了检测，得到的SERS谱图见图4，可见棕色片剂经样品预处理后的SERS谱图与他达拉非的标准谱图非常类似，几乎可以找到每一个他达拉非特征峰，这说明该样品中添加了大量的他达拉非类成分，RS3000也可以直接报出他达拉非报警。另一种胶囊经样品预处理后的SERS谱图没有看到西地那非和他达拉非的特征峰，说明其中不含有这两种非法添加药物。

图4 对两款抗疲劳类保健品进行样品预处理和检测后得到的SERS谱图Fig.4 The Raman spectrum of two healthcare products analyzed by the method reported in this paper

另一个案例是消费者送样了一种棕色含片糖果，声称有抗疲劳功效，经SERS检测后发现其中含有他达拉非。图5是用本文方法对样品进行检测的结果，RS3000自动生成了检测报告，从实测谱图和标准谱图的对比可以看出，样品中可以找到他达拉非主要的特征峰，故判断其中含有他达拉非，RS3000可以直接报出他达拉非报警。

图5 某棕色含片的SERS检测报告(RS3000自动生成)Fig. 5 The test report of a brown candy analyzed by the method reported in this paper (report automatically generated by RS3000 Raman spectrometer)

从北京微量化学研究所获得了18份保健品实际样品，经SERS检测的结果与实验室检测的定性结果100%吻合。这些样品已经使用实验室标准方法完成了定性检测，14份样本含有西地那非而4份不含有(表2)。使用本文开发的西地那非和他达拉非同时检测的SERS方法对这些样品一一进行了检测，SERS的定性结果和实验室定性结果完全吻合。这一比对实验证明本文的同时检测方法具有很高的准确性，可以与实验室方法相匹配。

表2 18个保健品实际样品的实验室检测方法和拉曼检测结果对照Table.2 Test results of 18 healthcare products by laboratory standard methods and SERS

4 结论

本文建立了一种基于SERS的保健食品中非法添加西地那非和他达拉非的同时多项检测方法。该方法可同时对西地那非和他达拉非做多项筛查，检出限为西地那非5 mg/kg，他达拉非10 mg/kg，可测胶囊、片剂类大部分抗疲劳类保健品，检出限和定性准确度与HPLC-MS方法相当。本文所研究的检测方法显著提升了西地那非和他达拉非SERS检测方法的检测效率和检测灵敏度，有助于该技术在公安等快检场景的进一步推广应用。