基于表面增强拉曼光谱技术的多通道同时快速检测原烟中的多菌灵和甲基硫菌灵

李霞，陈晓水，黄艺伟，杨君，周国俊*，李剑锋*

(1.浙江中烟工业有限责任公司，浙江 杭州 310008；2.厦门大学，福建 厦门 361005)

1 引言

多菌灵和甲基硫菌灵同属于苯并咪唑类，是具有高效、广谱、低毒等特点的一类杀菌剂，其原理是通过干扰病原菌有丝分裂中纺锤体的形成，影响细胞分裂，从而起到杀菌作用，被广泛应用于农业生产中植物真菌病害的防治，同时也是烟草登记使用的农药，用于烟草白粉病、根黑腐病等的防治。甲基硫菌灵在植物体内可代谢为多菌灵。研究发现，多菌灵和甲基硫菌灵对哺乳动物有一定的毒害作用[1]，同时烟草在燃烧后仍有部分多菌灵和甲基硫菌灵(2.2～4.5%)能够保持分子的原有结构，然后通过主流烟气进入到人体内从而对人体健康造成损伤[2]。国际烟草科学研究合作中心(CORESTA)规定了烟草中多菌灵的指导性残留限量。因此，发展烟草中多菌灵和甲基硫菌灵残留的检测分析方法很有必要。

目前，烟草中农药残留的检测方法主要有：气相、液相色谱及其与质谱联用技术[3-5]、分光光度法[6]、免疫分析法[7]等。色谱检测方法具有准确性高，结果稳定、重复性好的优点，但往往需要复杂的提取、净化等前处理过程，周期长、成本高，且需要昂贵的分析仪器，不能满足大量样品和现场快速检测需求。现有分光光度法简单易行，但存在灵敏度低、检测范围小、易出现假阳、假阴性等问题。免疫分析法是一种有效而快速的方法，但是在获得高效和高特异性的抗体，以及提高方法检测灵敏度和检测限方面，仍待进一步研究和改进。而且，由于多菌灵与甲基硫菌灵的化学性质相似，目前的快速检测方法中经常未能解决它们之间的相互干扰问题。因此，寻求成本低、操作简便、检测速度快、灵敏度高且两种农药不相互干扰的方法，具有重要的现实意义。

表面增强拉曼光谱技术(SERS)是一种具有超高灵敏度的指纹光谱技术，甚至能够达到单分子检测级别，现已广泛应用在食品和农产品中危害物质、食用添加剂、农药残留等的快速检测[8-10]。例如，Alsammarraie等[11]制备了有序阵列的纳米金棒活性SERS基底来对果汁和牛奶中的西维因进行检测，检测灵敏度可达50 ppb。Chen等[12]将纳米粒子粘附在胶带上来制备SERS基底，从而对蔬菜水果中的甲基对硫磷、福美双、毒死蜱等农药残留进行快速检测。近年来，有关SERS检测农药的相关研究报道日趋增多，SERS技术在农药残留的现场快速检测方面突显出了很大的应用价值。例如，吴燕等人[13]以表面增强试剂为基底，利用SERS技术对茶叶中的多菌灵进行检测；李俊杰等[14]则利用SERS技术来对脐橙样品中不同质量分数噻菌灵标准溶液和基质标准液进行拉曼检测。然而，上述方法都是通过利用SERS技术来对单一的农药进行检测，而对烟草样品中多菌灵和甲基硫菌灵进行同时检测的方法却未见相关报道。基于此，本工作利用便携式拉曼光谱仪结合前处理技术开展烟叶中多菌灵和甲基硫菌灵的同时快速检测。通过优化前处理条件，使得多菌灵与甲基硫菌灵分离于同一前处理液的不同溶液层中，并用便携式拉曼光谱仪分别进行检测。该方法只需结合简单前处理便可准确区分检测多菌灵与甲基硫菌灵，实现了多通道的快速检测，检测灵敏度低、检测速度快、成本低、操作简便，适用于现场批量样品的快速筛查。

2 实验部分

2.1 试剂

多菌灵(分析标准品，99%)、甲基硫菌灵(分析标准品)、乙腈(分析纯)、环己烷(分析纯)、溴化钾(分析纯)、碳酸钾(分析纯)、氯化钠(分析纯)和无水硫酸镁(分析纯)均购于阿拉丁化学试剂有限公司，PSA(N-丙基乙二胺键合固相吸附剂)购于安捷伦科技有限公司，纳米金(粒径约为55 nm)增强试剂购于厦门赛纳斯科技有限公司。

2.2 仪器

便携式拉曼光谱仪(SHINE-P785N厦门赛纳斯科技有限公司，激发光波长785 nm，最大激光功率为500 mW)，超纯水仪(Heal-force，smart-N系列)，高速离心机(湘仪 H2500R)，漩涡振荡器(VORTEX-GENIE2)。

2.3 实验方法

2.3.1多菌灵和甲基硫菌灵标准品的拉曼光谱采集

将标准品多菌灵/甲基硫菌灵固体粉末置于干净的载玻片上压平后，直接用便携式拉曼光谱仪进行拉曼光谱采集，获取拉曼光谱。

采用逐级稀释的方法，分别配制不同浓度的多菌灵、甲基硫菌灵标准酸性水溶液(0.2 mg/kg、0.1 mg/kg、0.05 mg/kg、0.01 mg/kg、0 mg/kg)。

多菌灵的检测：取100 μL标准液，加入50 μL团聚剂1(1 mol/L碳酸钾与1 mol/L溴化钾水溶液按体积比1：4混合)，加入300 μL纳米金溶胶，混匀，于便携式拉曼光谱仪进行图谱采集；

甲基硫菌灵的检测：取200 μL标准液，加入50 μL团聚剂2(1 mol/L氯化钠水溶液)，加入200 μL纳米金溶胶，混匀，于便携式拉曼光谱仪进行图谱采集；

拉曼检测条件：激发光785 nm，激光功率500 mW，扫描时间5000 ms。

2.3.2原烟样品的前处理

准确称取磨粉后的原烟空白样品0.5 g于离心管中，分别添加农药标准品至浓度为0、0.5、1、3、5、7 mg/kg，自然晾干，备用。然后取上述待测样品0.5 g，加入4 mL有机试剂(乙腈和甲苯按5∶1的比例混合)，将烟丝用有机试剂完全浸湿，然后超声振荡2 min，再将有机层取出置于新离心管(离心管中含有0.2 g无水硫酸镁和0.025 g PSA(N-丙基乙二胺键合固相吸附剂)，振荡、离心，取上层有机层吹干，加入500 μL纯水和250 μL环己烷复溶，离心分层，得到上层多菌灵待测液，下层甲基硫菌灵待测液。

2.3.2SERS检测

多菌灵的检测：取100 μL上层待测液于样品管中，按上述标准品的检测方法进行检测，获得拉曼图谱，并与多菌灵标准品SERS谱对比；

甲基硫菌灵的检测：取200 μL下层待测液于样品管中，按上述标准品的检测方法进行检测，获得拉曼图谱，并与甲基硫菌灵标准品SERS谱对比。

图1 烟叶中多菌灵和甲基硫菌灵的检测示意图

3 结果与讨论

3.1 多菌灵、甲基硫菌灵的拉曼光谱分析

由于拉曼光谱的峰位移、强度及拉曼峰形状反映物质化学键的振动或转动频率，是确定化学键、官能团的重要依据，因此通过分子的拉曼光谱可以确定分子的结构。首先，分别采集多菌灵的固体谱和SERS谱，结果如图2a所示。由图可知，多菌灵的固体谱和SERS谱的主要特征峰位置基本相符且与文献报道的相一致[15]，证明了获得的SERS谱即为多菌灵的SERS谱。同时，根据之前的文献报道在625 cm-1处的多菌灵的拉曼信号，为C-C-C的面内弯曲振动，而756 cm-1、940 cm-1则归属于苯环中C-H 的面外弯曲振动，1006 cm-1和1224 cm-1分别归属于苯环的变形振动和N-H 的面内弯曲振动，1263 cm-1归属于C-N的伸缩振动和C-H面内弯曲振动的耦合。同时，上述特征峰峰强较为明显，可作为SERS光谱检测多菌灵的判别依据。

类似的，我们分别对甲基硫菌灵的固体谱和SERS谱进行采集，得到图2b所示拉曼谱图，并且甲基硫菌灵的固体谱和SERS亦是相对应的。其中在605 cm-1处的拉曼信号，为N-H 的变形振动，在712 cm-1、1039cm-1处的拉曼信号，可归属于苯环上的C-H的变形振动，在961 cm-1和1189 cm-1处的拉曼信号，分别归属于苯环上的C-H的变形振动和分子中-CH3的变形振动，以及-CH3的变形振动，在1259 cm-1处的拉曼信号，则为N-H和C-H的变形振动。因此，上述特征峰可作为SERS光谱检测甲基硫菌灵的判别依据。

图2 (a)多菌灵的分子式、常规拉曼光谱及其表面增强拉曼光谱；(b)甲基硫菌灵的分子式、常规拉曼光谱及其表面增强拉曼光谱

图3所示的拉曼光谱图为不同浓度(0.2 mg/kg、0.1 mg/kg、0.05 mg/kg、0.01 mg/kg、0 mg/kg)的多菌灵和甲基硫菌灵标准溶液的SERS谱图，由图可知，多菌灵和甲基硫菌灵的SERS谱中特征峰峰强随着浓度的减小而减小，且均在浓度低至0.01 mg/kg时仍能明显识别。表明，该方法对多菌灵和甲基硫菌灵标准溶液的检出浓度均可达到0.01 mg/kg。

图3 (a)不同浓度多菌灵标准溶液SERS谱(b)不同浓度甲基硫菌灵标准溶液SERS谱

3.2 原烟样品中多菌灵和甲基硫菌灵的检测

烟草样品成分的多样性和复杂性，为表面增强拉曼光谱的检测带来一定的干扰。本文首先采用N-丙基乙二胺键合固相吸附剂(PSA)和无水硫酸镁作为净化剂，除去原烟样品中色素及多酚等的干扰影响(详细前处理步骤如实验部分2.3.2所示)。因甲基硫菌灵在植物体内可代谢为多菌灵，故在喷洒过甲基硫菌灵农药的原烟样品中通常同时存在多菌灵和甲基硫菌灵残留。为了排除多菌灵和甲基硫菌灵分子在表面增强拉曼基底表面的竞争吸附，我们将多菌灵与甲基硫菌灵分离于同一处理液的不同溶液层中，进而分别得到原烟样品中多菌灵和甲基硫菌灵的SERS光谱(见图4)，实现多通道检测。由图4a可知，原烟中多菌灵的浓度为1 mg/kg时，625 cm-1、940 cm-1、1006 cm-1、1224 cm-1和1263 cm-1等多菌灵SERS特征峰仍能明显识别，当浓度低至0.5 mg/kg时，所得的SRES光谱与空白原烟样品相似。实验结果表明，该检测方法对原烟中多菌灵农药残留的最低检出浓度可达到1 mg/kg。相似的，在甲基硫菌灵的加标样检测中，当原烟的加标浓度为1 mg/kg时，甲基硫菌灵在605 cm-1、712 cm-1、961 cm-1和1189 cm-1处的特征峰可以明显识别。当浓度低至0.5 mg/kg时，所得的SRES光谱与空白原烟样品的相似，说明该检测方法对原烟中甲基硫菌灵农药残留的最低检出浓度可达到1 mg/kg。

图4 (a)不同浓度的原烟多菌灵提取液的表面增强拉曼光谱；(b)不同浓度的原烟甲基硫菌灵提取液的表面增强拉曼光谱

4 结论

本文建立了一种利用表面增强拉曼光谱技术，多通道快速检测烟草中多菌灵和甲基硫菌灵的方法。该方法首先采用环己烷和纯水将多菌灵与甲基硫菌灵分离于不同的溶液层中，然后以便携式拉曼光谱仪分别进行检测，得到相应的SERS光谱。该方法前处理简单，一次前处理便可满足多菌灵和甲基硫菌灵的同时检测。测试结果表明，烟叶中多菌灵和甲基硫菌灵残留量的检测灵敏度均为1 mg/kg，检测时间为10～15 min。为烟叶中痕量农药的检测提供一种快速、准确、灵敏的分析检测途径。烟草中对于农残的检测不仅仅包括母体化合物，还有其同系物、分解产物等等。同时，农残样品的最大残留量不断下降，新型农药的不断研制和应用，这些都对农残的检测提出了新的要求与目标。因此，发展稳定性好、灵敏度高、适用范围广，而且可以同时进行快速及多元化的检测技术以及分析方法是未来的发展趋势与难点。而光谱技术可以实现对样品的大批量、快速检测，可以实现对烟草生产和销售环节的快速筛查，因此加快光谱分析技术的研究与发展，逐步实现对烟草农残检测的大批量快速、无损检测具有重要意义和发展前景。