乳腺癌的傅里叶变换红外光谱成像研究

陆燕飞，朱勇康，赵远，徐新宇，尹建华*

(1.南京航空航天大学 自动化学院，南京 211106；2.江苏省肿瘤医院 病理科，南京 210009)

1 引言

乳腺癌是全世界女性中最常见的癌症[1]。据国家癌症中心发布的2018年全国最新乳腺癌报告，在中国，女性乳腺癌的发病率和死亡率分别为女性恶性肿瘤的第1位和第5位。21世纪以来，我国女性乳腺癌发病率呈持续上升趋势[2]。乳腺癌患者的生存率与诊断时癌症的等级密切相关[3]。因此，对乳腺癌进行精确/分子的研究、及早的发现和准确的诊断对提高乳腺癌患者的预后和生存率具有决定性意义。

目前，进行乳腺癌研究的方法包括影像学检查[4](乳腺钼靶、超声检查、CT和MRI扫描)、前哨淋巴结活检[5]、细针穿刺吸取细胞检查[6]、手术切除活检[7]、肿瘤标志物检测[8]、血液学检查[9]等。除此之外，光谱技术也被广泛地应用于癌症的研究[10-12]。

傅里叶变换红外(FTIR)光谱与显微镜的结合已广泛应用于化学工业和法医学中的化学鉴定和结构分析，并且被公认为组织病理学研究的新兴工具[13-15]。FTIR成像基于组织中分子的振动跃迁吸收红外光，提供了构成细胞和组织所有大分子(例如DNA，RNA，脂质，蛋白质和碳水化合物)的化学组成以及空间分布信息，而不需要对组织切片进行任何特定的染色或添加试剂[16-18]。与定性组织染色相比，这些图像还包含定量信息，可以提取光谱进行数值分析[19-20]。组织的光谱特征高度代表其组织病理学状态，不仅可用于区分健康和病理标本，还可用于区分不同类型或等级的肿瘤病变[21-22]。Frederik等[23]通过FTIR成像和新型的分类器自动鉴定新鲜冰冻肺癌组织切片的类型和腺癌亚型。Jayakrupakar等[24]使用红外光谱微成像以非破坏性方式对10个冷冻结肠组织样品(来自5名患者的5个非肿瘤和肿瘤对)进行成像。通过多变量聚类方法处理光谱图像，以无标记方式识别组织。Xavier等[25]使用红外光谱成像以及基于遗传学的新型机器学习技术进行前列腺癌的诊断，表明这种方法可以改善目前诊断前列腺癌的临床实践。M. Verdonck等[26]将FTIR成像与PLS-DA结合，有效地鉴定石蜡包埋乳房组织切片中存在的主要细胞类型，即上皮细胞、淋巴细胞、结缔组织、血管组织和红细胞，并且可以区分健康和肿瘤乳腺上皮细胞。因此，FTIR成像或可成为诊断乳腺癌的有力工具。本文将通过FTIR成像以及光谱分析，对健康和癌变乳腺组织进行对比研究。

2 实验材料与方法

2.1 样本制备

健康和癌变乳腺组织由江苏省肿瘤医院术中切除后留存。经患者知情同意后，共有5组乳腺组织用于FTIR成像实验。癌变组织样本和健康组织样本切成2 mm×2 mm×2 mm大小快速冰冻，然后使用低温切片机(Leica CM 1950, Germany)在-20℃的条件下将其切成10m厚的切片，最后在室温下风干用于FTIR成像实验。

2.2 实验仪器及数据采集

实验采用PerkinElmer公司的Spotlight-400傅里叶变换红外光谱成像系统。经背景扫描后，再对健康和癌变乳腺组织切片进行成像扫描，获得可见光图像和(全吸收)红外光谱图像。FTIR成像的单个像素大小为6.25m×6.25m，2次扫描。红外光谱扫描范围是4000～744 cm-1，光谱分辨率为16 cm-1。

2.3 光谱图像分析方法

FTIR图像中每个像素代表了对应位置的一条红外光谱，并且通过伪彩色表示该像素点对红外光的平均吸光度[27]，同时特征带图像分析可以直观地展现样本切片中各种成分的空间分布以及它们的含量变化。首先对所采集的FTIR图像提取红外光谱；再以该光谱的两个特征谱带的吸光度比值为第三维变量自动绘制图像(特征比图像)。红外光谱图像的平均或单像素光谱的提取及光谱分析是采用该成像系统自带的Spotlight 400软件完成，并用来生成特征带吸光度比的红外图像。

3 结果与讨论

3.1 FTIR图像分析

图1所示为较具代表性的乳腺组织切片图像，分别为健康和癌变组织切片的全吸收FTIR图像及对应的可见光图像。通过这些图像对比发现无论是健康组织还是癌变组织，其成分和形貌微观上都是非均匀分布，意味着可能的异质结构。然而它们却无法有效区分健康和癌变乳腺组织，因此进行光谱分析和图像分析是必要的。

图1 健康(a)和癌变(b)乳腺组织样本的全吸收红外及可见光图像，图像大小为1000 m×250 m

Fig.1 The corresponding visible and (total abs.) FTIR images of healthy (a) and cancerous (b) breast samples. The size of each image is of 1000m×250m

图2所示为提取自健康乳腺组织(图1(a))中某一像素点的红外光谱，各个特征峰的分配见表1[28-30]。其中各特征带1740、1455、1400 cm-1都和脂类相关，1650、1550 cm-1来自蛋白质分子，1238、1087 cm-1则与核酸相关。这些特征带的分配或者它们之间的吸光度比值均含有较强的大分子浓度信息，暗示着在不同生理或病症条件下的生物大分子的构成甚至结构的变化。具体如下文及图3所示。

图2 健康乳腺组织切片的红外光谱

表1 乳腺组织FTIR谱带的分配[28-30]

Table 1 The characteristic IR bands of breast tissue and assignments

波数(cm-1)振动模式分配1740νC=O脂类1650AmideI蛋白质1550AmideII蛋白质1455δC-H脂类相关1400δC-H,δC-O-H脂类相关1238νas,PO-2核酸相关1160νC-O,δC-O-H,δC-O-C碳水化合物1087νs,PO-2核酸相关

注：ν 伸缩振动，νs对称伸缩振动，νas反对称伸缩振动，δ 面内弯曲振动

图3所示为健康和癌变组织切片的FTIR图像在不同特征带吸光度比(峰面积比)的情况下生成的特征比图像。图像中颜色的深浅代表该比值的高低(A表示吸光度)，反映了组织中特征成分含量的变化。从图中颜色对比可以直观发现，相对于健康组织，癌变组织的特征吸光比A1087/A1455、A1238/A1455、A1550/A1455、A1650/A1455明显增加；A1160/A1087、A1740/A1550则减小。图像结果直观地反映了健康和癌症乳腺组织成分含量的变化。

具体来看，A1550/A1455、A1650/A1455为蛋白质相对于脂类的含量。在癌变组织中癌细胞代谢旺盛消耗能量，脂肪在组织癌变时难以积累，含量减少[31]。与此同时，蛋白质合成增加，所以A1550/A1455和A1650/A1455比值增加。A1740/A1550表明脂质与蛋白质的含量比，同上，很容易理解癌变组织中的比值小于健康组织。

A1087/A1455、A1238/A1455表现为核酸相对于脂类的含量。与健康组织相比，癌变组织中癌细胞增加，DNA无限复制。并且，癌细胞易出现多倍体，导致染色体组数增加[32]。因此，癌变组织中核酸含量增加，同时伴以脂肪减少，导致癌变时A1087/A1455和A1238/A1455比值明显增加。1160 cm-1谱带为碳水化合物的吸收带，随着癌细胞的剧烈分裂，大量的糖作为营养物被消耗并且核酸含量相对增加，因此，癌变时A1160/A1087比值减小。

通过以上分析可见，对于健康和癌变的不同样本，FTIR特征带图像分析可以明确给出健康与癌变组织的差异以及癌变过程中主要大分子含量的变化。

3.2 FTIR光谱分析

图4是从健康和癌变乳腺组织切片的FTIR图像中提取的平均红外光谱，反映的是整个成像样本的平均效果(光谱)。图中可见，2条谱线在1740(1455), 1650及1160 cm-1处有明显的特征区别，分别反映了癌变过程中脂肪含量的减少、蛋白质的增加及碳水化合物含量的降低。然而却不能表征出癌变过程中核酸含量的变化。为此，分别计算各个谱带的吸光度及它们之间的比值(含平均误差)，如表2所示。从表2中可以发现健康与癌变样本组织之间的变化规律，癌组织的A1087/A1455、A1238/A1455、A1550/A1455、A1650/A1455比值相对于健康组织明显增大，A1160/A1087、A1740/A1550则减小，这些结果与实验中多组乳腺组织样本的FTIR图像分析是一致的。

图3 健康和癌变乳腺组织的特征谱带吸光度比值的红外图像。图像大小为1000 m×250 m

Fig.3 FTIR images of the characteristic band absorbance ratios of healthy and cancerous breast tissues, The size of each image is of 1000m×250m

图4 健康和癌变乳腺组织切片FTIR图像的平均光谱

Fig.4 The mean IR spectra extracted from entire slices of healthy and cancerous breast tissues, respectively

综上，图1和3中FTIR图像不仅实现了样本的微观成像，相较于FTIR成像的单像素大小(6.25m×6.25m)来说，某种程度上也体现了组织样本局部的综合效果。因此图3的结果一定程度上一致于成分含量变化的平均效应。如果进一步缩小图像大小，在更微小区域体现不同样本成分含量的变化，则随机变化增加，有时会得出和平均结果不同的结果，这则体现出生物组织样本内部结构的非均一化或异质异构的存在，这一点在图1的全吸收FTIR图像及可见光图像甚至图3的比较中也是明显可见的。因此，对FTIR图像分析，根据所选择区域大小及图像处理的方式方法，如单像素取谱、整区域提取平均光谱、单一特征带成像(chemimap)及特征带间吸光度比图像(chemimap of ratio)等，证实FTIR成像技术可同时实现微观测量和小面积宏观测量、主成分含量变化分析等，从而可满足于不同诊测的需求。

表2 健康及癌变乳腺组织平均红外光谱的吸光度(峰面积)比

Table 2 Absorbance (peak area) ratios of mean IR spectra of healthy and cancerous breast tissues with mean error in brackets

吸光度比健康(6.0%)癌变(9.0%)A1087/A14551.86195.5231A1238/A14551.35143.5650A1550/A14553.52659.6962A1650/A14557.978923.8922A1160/A10870.15470.0022A1740/A15500.26640.0057

4 结论

本文采用FTIR成像技术对乳腺组织切片进行研究，通过FTIR图像分析表明FTIR成像可以用于准确区分判断健康和癌变乳腺组织。结合FTIR光谱分析结果，更加证明了特征比图像的判别准确性和直观性。本研究不仅从分子层次对乳腺的癌变进行了研究，同时也进一步表明了FTIR成像技术在乳腺癌诊断方面的可行性，是进行基础研究甚至是临床医学诊断的一种准确有效的工具手段。如果进一步结合图像处理和算法进行深度分析处理，有可能获得事半功倍准确高效的研究结果，有效促进未来的医学发展和实验室研究，相信这也是本领域未来的一个热点方向。

致谢：感谢国家自然科学基金(61378087)，江苏省六大人才高峰计划(SWYY-034)，江苏省研究生科研与实践创新计划项目(KYCX18_0321)资助，感谢上海海洋大学许长华副教授课题组及Perkin Elmer公司工程师的实验协助。