基于SERS法的苹果中农药残留的定性及定量分析

赵琦，刘翠玲，孙晓荣，苗雨晴

(北京工商大学计算机与信息工程学院，北京　100048)



基于SERS法的苹果中农药残留的定性及定量分析

赵琦，刘翠玲*，孙晓荣，苗雨晴

(北京工商大学计算机与信息工程学院，北京100048)

摘要:使用共焦显微拉曼光谱仪，结合表面增强拉曼散射(Surface-Enhanced Raman Scattering,SERS)技术，采集含有农药马拉硫磷和二嗪农的苹果汁样本的基于银纳米溶胶的表面增强拉曼光谱，采用距离匹配和判别分析的方法对其进行定性分析。然后结合偏最小二乘(Partial Least Squares,PLS)方法对两种农药的表面增强拉曼光谱分别进行数学建模分析。结果表明表面增强拉曼散射(SERS)技术对无损快速定性分析马拉硫磷和二嗪农具有较高的准确性，而定量分析二者的含量也具有较高的可行性。

关键词：表面增强拉曼散射；银纳米溶胶；定性分析；定量分析

1引言

1874年欧特马·琴德勒首次合成DDT，1939年瑞士化学家P.H.Müller发现了化合物DDT强大的杀虫剂功效，使农药从天然药物与无机合成农药并存的阶段直接进入了合成有机农药的阶段。当农药使农作物产量增加、提高经济效益的时候，带来的问题也逐渐显露。美国环境工作组(EWG)连续10年发布的受农药污染最严重的农产品排行榜中，约65%的农产品样本检测呈阳性，其中苹果位居12种农药污染排行榜之首，几乎每个样本的农药残留量都高达99%，残留农药种类至少有一种。针对这一问题，自上世纪70年代开始，相关农药残留检测分析技术逐渐发展进步。如今，经典测试方法有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气-质联用法(GC-MS)、液-质联用法(LC-MS)等，现已发展的十分成熟，是农药残留测定最常用且不可或缺的手段[1-3]。试纸法和传感器法也被广泛应用于田间地头的初步快速筛查。但这些方法也存在一些弊端，经典检测方法准确性高，但样品前处理复杂，即使是现在比较流行的QuEChERS快速样品前处理技术，也要经过样品称量、涡旋、离心、萃取、过滤等多步后才能进行上机[4]。试纸法和传感器法适用于快速检测，但检测产生的大量有毒试纸试剂如得不到安全有效的处理，又会对环境造成更加严重的二次污染。光谱技术(原子荧光光谱法、紫外-可见光谱法、红外光谱法、拉曼光谱法、高光谱成像检测技术等)则因其快速、环保等优点成为近些年逐渐发展起来的农残检测方法。而拉曼光谱技术特别是表面增强拉曼光谱技术因其高分辨率、高灵敏度，不易受水的干扰等优点越来越多的应用于痕量物质[5-6]，如农兽药残留、违法添加剂的检测研究等[7-10]。

国内外在应用拉曼光谱技术检测果蔬农药残留中取得了一定的进展。其中，Fan等[11]采用金溶胶作为表面增强剂利用SERS法检测苹果中的亚胺硫磷，结果显示标准样本溶液的亚胺硫磷检出限可达到1 μg/mL，苹果提取物的亚胺硫磷检出限可达到1 μg/g，表明其方法一定程度上可用于痕量污染物分析复杂食品基质中亚胺硫磷。李小舟[12]等选用苹果和有机磷农药倍硫磷、甲拌磷为研究对象，采用SERS技术探索了两种农药在苹果表面的快速无损检测方法，实验发现：表面增强拉曼散射光谱可有效识别倍硫磷和甲拌磷的特征信号，然后分别以728 cm-1、1512 cm-1波段处的拉曼信号作为两种农药定标峰建立定量标准曲线，为表面增强拉曼散射光谱技术定量分析甲拌磷、倍硫磷的含量提供了参考。Jitraporn[13]等分别使用金、银纳米溶胶粒子作为表面增强基底获得了农药地虫磷的表面增强拉曼散射光谱，发现地虫磷分子在两种金属表面的吸附特性不同，特征信号的增强效果也不同，其中基于银纳米粒子的地虫磷检测限可达10 ppm。Shintaro[14]等采用纳米银做表面增强基底研究了水胺硫磷、氧化乐果、甲拌磷和丙溴磷四种农药的表面增强拉曼散射光谱，主成分分析显示四种农药的检测限分别为1 ppm、5 ppm、0.1 ppm和5 ppm。

本研究采用共焦显微拉曼光谱仪结合SERS技术，分别采集苹果汁中有机磷农药二嗪农和马拉硫磷的表面增强拉曼光谱，之所以以苹果汁作为样本背景，没有选择农药最易残留的苹果皮，是因为根据GB2763-2014《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中的规定，最大残留量的限定单位为mg/kg，如果选取苹果皮，残留量标准不易换算。之后采用判别分析和距离匹配两种定性分析方法建立两种农药的定性分析模型，再采用偏最小二乘(PLS)建模方法建立其定量模型，旨在探索表面增强拉曼散射技术定性及定量分析有机磷农药的可行性及准确性，找出最佳建模方法，以期找到更加综合全面、高效省时的农药残留拉曼检测方法。

2材料与方法

2.1试剂与仪器

甲醇中马拉硫磷溶液标准物质：标准值1.00 mg/mL，相对标准不确定度(%)(k=2)为4；甲醇中二嗪农溶液标准物质：标准值1.00 mg/mL，相对标准不确定度(%)(k=2)为1。置于冷藏室中避光保存，使用前于室温(20±3℃)平衡，购自中国计量科学研究院标准物质所。

表面增强剂：Easy Peak(舒峰TM)科研型银纳米溶胶，购自上海纳腾仪器。

DXR激光共焦显微拉曼光谱仪(美国Thermo Fisher公司)，实验前用聚乙烯对拉曼光谱仪进行峰位校准。仪器参数设置：激光波长780 nm，激光能量24 mW，光栅400 lines/mm，光阑50，估计分辨率4.7~8.7 cm-1，物镜MPlan 10x/0.25，采集曝光时间5 s，荧光修正。

2.2实验方法

2.2.1样本制备

将市购有机苹果用去离子水洗净晾干后粉碎，并经过滤取其汁液为背景，配制马拉硫磷(国标最大残留量2 mg/kg)质量分数在0.1~15.3 mg/kg的梯度样本35个作为预测样本，配制二嗪农(国标最大残留量0.2 mg/kg)质量分数在0.02~3.29 mg/kg的样本23个，该质量分数范围分布都在国标最大残留量附近，具有实际意义。

2.2.2光谱数据采集

分别取2.2.1中配制好的样本200 μL与银(Ag)纳米溶胶1∶1(v∶v)混合均匀后注入液体池中，在室温及光照环境相对恒定的条件下采集光谱待分析。在光谱采集前先要对样本进行聚焦，首先利用显微镜头进行观察，将光源聚焦在液体池底部，如图1所示。再通过微调将载物台缓缓向下移动，直至池底逐渐模糊，有时可观察到样本中的细微杂质，如图2所示即确定正确聚焦在苹果汁样品上。

Fig.1Focus micrograph of bottom of the liquid pool

Fig.2Focus micrograph of the apple juice sample

采集的光谱如图3所示。再对单一苹果汁样本按上述方法进行拉曼光谱采集，并将苹果汁样本光谱图与加入了农药的样本进行了对比，对比图如图4所示。图中的三条光谱分别为单一苹果汁样本和两种农药样本中的最高及最低浓度样本的拉曼光谱。

Fig.3　Surface enhanced Raman spectroscopy of two kinds of pesticides

Fig.4　Contrastive spectroscopy(background/residues)

3分析与建模

3.1定性分析

如图3、图4所示，肉眼并不能直观的从光谱图中直接分辨出两种农药，所以需要借助一些定性分析算法。本文选取的是距离匹配和判别分析两种定性分析算法。

另外本研究为提高信噪比，减小随机噪音，消除基线偏移并放大和分离重叠信息，对2.2.2中采集的光谱采用一阶导数+Norris Derivative滤波进行预处理，然后分别采用判别分析及距离匹配两种方法建立定性模型，并从每种农药中各随机挑选3个样本对模型进行测试，结果如图5、图6所示，横纵坐标分别代表每个样品相对两类样品的判别距离，d代表二嗪农(diazinon)，m代表马拉硫磷(malathion)。

Fig.5Discriminant analysis model and the test results

Fig.6Distance matching model and the test results

从测试结果图中可以看出，两种方法的6个测试样本均被准确无误地分到各自的类别中，定性鉴别正确率为100%，多次随机更换测试样本，都能得到相同结论。

3.2定量分析

从图4中也可看出，不同残留物浓度样品的光谱图的直观差别并不明显，所以本文考虑借助定量分析算法进行进一步的研究。同样对2.2.2中采集的光谱采用一阶导数+Norris Derivative滤波进行预处理后，采用PLS法分别建立两种农药的定量分析模型，并各挑选三个样本作为测试集，检验所建模型的预测效果。因光谱中可能含有一些无法直接观察到的有用信息，为防止人为忽略，本次定量研究选取全波段光谱进行分析。

基于PLS法的两种农药的定量分析模型拟合效果都较好，其中如图7所示，马拉硫磷定量模型的相关系数为0.99，校正均方根误差为0.02，校正样本的拟合值与真实值的最大残差为0.059 mg/kg。

而测试样本(图中箭头所指)的预测效果相对于校正样本的拟合效果要差，具体结果如表1所示。

Table.1　Predicting result of malathion

可以看到，三个测试样本的真实值与预测值的偏差分别为0.46,0.3,0.24 mg/kg，浓度越高的样本预测效果越好。

二嗪农定量模型的相关系数为0.99(见图8)，校正均方根误差为0.01，校正样本的拟合值与真实值的最大残差为0.03 mg/kg。

同样，测试样本(图中箭头所指)的预测效果相对于校正样本的拟合效果要差，具体结果如表2所示。

Table.2　Predicting result of diazinon

与马拉硫磷的定量模型的效果相比，二嗪农的整体预测效果更好，三个测试样本的真实值与预测值的偏差分别为0.2，-0.14，-0.1 mg/kg，但也存在高浓度样本预测精准，低浓度样本预测较差的现象。

Fig.7　Calculated curve and residual plot (malathion)

Fig.8　Calculated curve and residual plot (diazinon)

4结论

本研究采集了含有有机磷农药二嗪农与马拉硫磷的苹果汁样本的基于纳米银溶胶的表面增强拉曼光谱，并建立了二者的定性与定量模型。研究表明，基于定性模型可以准确完全的区分两种农药，正确率为100%，适用于快速定性分析苹果中含有何种农药。而定量模型中二嗪农的效果优于马拉硫磷，且两个模型都是校正拟合效果较好，测试样本的预测效果稍差，特别是对于低浓度的样本，残差百分比相对较高，所以所建模型较适用于高浓度样本的快速检测。对于低浓度样本，应该从提高其预测精度的角度入手再进行后续研究。

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Qualitative and Quantitative Analyzing on Pesticide Residue in Apple Using SERS

ZHAO Qi，LIU Cui-ling*，SUN Xiao-rong，MIAO Yu-qing

(SchoolofComputerandInformationEngineering，BeijingTechnologyandBusinessUniversity，Beijing100048，China)

Abstract:Confocal micro Raman spectrometer combined surface enhanced Raman scattering (SERS) was introduced in collecting surface-enhanced Raman spectroscopy of apple juice samples contained pesticide malathion and diazinon.Distance match and discriminant analysis methods were used to build two kinds of mathematical models for qualitative analysis respectively.Then partial least squares was used to building the quantitative model,the results show that the qualitative analysis based on surface-enhanced Raman scattering (SERS) to detect trace levels of malathion and diazinon has high accuracy,and the quantitative analysis can be accurate and feasible.

Key words:surface-enhanced Raman scattering (SERS);silver(Ag) sol; qualitative analysis; quantitative analysis

中图分类号：S-123

文献标志码：A

doi:10.13883/j.issn1004-5929.201601003

作者简介：赵琦(1992-)，女，硕士研究生，光谱检测技术与智能信息化处理，E-mail:zqbyzgz@163.com通讯作者：刘翠玲，E-mail:liucl@btbu.edu.cn

基金项目：北京市自然科学基金资助项目(4142012)；北京市教委科研计划重点项目(KZ201310011012)；北京市教委科技创新平台(PXM_2012_014213_000023)

收稿日期：2015-07-03; 修改稿日期:2015-10-29

文章编号：1004-5929(2016)01-0006-06