亚硒酸钠对胡萝卜愈伤组织诱导形成的影响

武晓英,王 青,乔宏萍,郝雪峰,吴丽华,郝彩霞,曹贵东

(1.太原师范学院生物系,山西 太原 030031; 2.山西新福瑞沃生物技术工程有限责任公司,山西 太原 030012)



亚硒酸钠对胡萝卜愈伤组织诱导形成的影响

武晓英1,王 青1,乔宏萍1,郝雪峰1,吴丽华1,郝彩霞1,曹贵东2

(1.太原师范学院生物系,山西 太原 030031; 2.山西新福瑞沃生物技术工程有限责任公司,山西 太原 030012)

选取新鲜胡萝卜的形成层为试验材料,研究亚硒酸钠对胡萝卜愈伤组织诱导形成的影响．在添加2.0 mg/L 2,4-D和0.8 mg/L 6-BA的MS培养基中分别加入0，0.5，1.0，2.0 mg/L的亚硒酸钠诱导培养愈伤组织,观察愈伤组织的诱导情况并计算愈伤组织的诱导率,同时测定抗氧化能力的相关指标,包括总抗氧化能力、GSH-PX活力、SOD活力、H2O2浓度、MDA含量．实验结果表明:亚硒酸钠浓度为0.5 mg/L时,胡萝卜愈伤组织被有效诱导,愈伤组织生长状况最佳,抗氧化能力显著提高．

亚硒酸钠;愈伤组织;抗氧化能力

胡萝卜因含有多种营养成分,深受许多发达国家和地区的喜爱,在世界各地广泛栽培,是人们食用最多的蔬菜之一．胡萝卜的种植不仅具有良好的经济价值,而且也具有很高的药用价值[1]．胡萝卜中含有大量胡萝卜素,在人体内经吸收转化成维生素A,具有维持正常视觉和防治夜盲症的作用[2];其次胡萝卜中含有植物纤维,可加强肠道的蠕动,起到通便排毒的作用;同时胡萝卜中的木质素能提高机体免疫机制,可间接消灭体内癌细胞;此外,胡萝卜中的懈皮素、山标酚还能有效降脂、降压,是高血压、冠心病患者的食疗佳品[3]．

随着生物技术的不断发展,为了提高胡萝卜的产量,进一步改良品种,提高胡萝卜的抗病和抗虫力．近年来,国内外许多学者对胡萝卜的再生技术、体细胞的杂交技术、遗传转化与基因的标记克隆技术进行了广泛的研究,其中许多研究者在对胡萝卜组织培养进行大量研究[4]时,选取胡萝卜直根的形成层,作为生物反应器的受体,培育优良无性系,还用其建立了大量的快速繁殖体系[5]．

硒存在于自然界中,且在地质环境中分布极不均匀,含量也极少．在中国,低硒地带约占全部国土面积的72%,山西就处于贫硒带上．由于饲草的贫硒,通过土壤—植物—动物这条食物链,导致了越来越多有关畜禽缺乏硒的的资料被报道,不仅影响了动物的生长发育和繁殖,对人类的健康也造成了严重的影响[6]．而有关植物对硒的利用,是否为植物所必需还尚未有最终的定论．但已有研究表明,在硒的生理浓度范围内,硒对植物的作用表现在可以促进钾、锰、钙、铜、锌等微量元素的吸收．史衍玺[7]在土壤施硒的情况下证实,硒可以促进小白菜体内人类所必需的氨基酸含量增高、总蛋白含量也增高．

硒与组织的抗氧化性直接相关．既可以通过硒酶来清除ROS, 也可以间接地影响SOD活力,从而使机体内的氧自由基如H2O2和氧自由基代谢终产物含量如MDA含量降低[8]．目前有许多关于富硒农作物研究的报道,比如对番茄叶片喷施有机硒肥[9],叶面喷施硒对甜柿果实品质的研究[10],硒浸种对抗氧化酶活性的影响[11],高温、低温、盐胁迫下硒对作物生理代谢的影响[12]等等．这些研究都旨在清除农作物的氧自由基,提高作物抗逆性．但硒对胡萝卜愈伤组织诱导形成的影响还鲜有人报道．所以本试验选取胡萝卜作为诱导材料,探讨加入不同浓度亚硒酸钠后,对胡萝卜愈伤组织的诱导率及抗氧化性能的影响．从而建立更好的胡萝卜快速繁殖体系,为胡萝卜的组织培养,工厂化生产及遗传转化提供依据,并为胡萝卜的种植推广提供有价值的指导．

1 材料与方法

1.1 MS培养基配制与试验设计

MS培养基的配制:用KNO3,NH4NO3,MgSO4·7H2O,KH2PO4,CaCl2·2H2O配制10倍大量元素母液;用MnSO4·4H2O,ZnSO4·7H2O,H3BO3,KI,Na2MoO4·2H2O,CuSO4·5H2O, CoCl2·6H2O 配制100倍微量元素母液;用EDTA-Na2,FeSO4·7H2O配制100倍铁盐母液;用甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸、肌醇配制100倍有机物质母液．依次分别吸取大量元素、微量元素、铁盐和有机物质母液100 mL、10 mL、10 mL、10 mL置于烧杯中,加入生长激素2,4二氯苯氧乙酸(2,4-D)2.0 mg/L,6-苄基嘌呤(6-BA)0.8 mg/L和 30 g蔗糖,加水至900 mL,待蔗糖溶解后调pH至6.0,再加入6.5 g琼脂粉,最后定容至1 000 mL,置于121 ℃,2.2 kg/cm2蒸汽压下灭菌30 min．灭菌好的MS培养基分组加入不同浓度已过滤除菌的亚硒酸钠,设定4 个试验组,亚硒酸钠的浓度分别为0,0.5,1.0,2.0 mg/L,灌制于三角培养瓶中,每组6个重复．

1.2 材料处理

新鲜胡萝卜在流动的自来水下清洗,并刷洗胡萝卜表面的屑粒,清洗干净后,削去表皮并在超净工作台中对胡萝卜进行消毒．消毒程序为,胡萝卜切成小段置于75%乙醇中消毒5 min,然后用灭菌吸水纸吸干表面的乙醇,再把胡萝卜小段浸泡于1%升汞中消毒3 min,用无菌水冲洗3次,用灭菌吸水纸吸干待用．

将消毒过的胡萝卜置于无菌培养皿中,切除胡萝卜的木质部和韧皮部,选取形成层作为愈伤组织诱导的材料．将形成层切成大小适宜的方块,分别接种至4个不同试验组中,每个三角瓶中接种4～6块,然后置于25 ℃的恒温培养箱中进行光照培养30 d．

1.3 愈伤组织诱导观察与诱导率的统计

以一周为一个周期,观察愈伤组织的诱导情况．培养30天后,对4个组别的愈伤组织诱导率进行统计和分析．

诱导率=诱导愈伤个数÷接种胡萝卜总数×100%.

1.4 愈伤组织总蛋白与抗氧化指标检测

1.4.1 总蛋白的测定

准确称取不同试验组培养的胡萝卜愈伤组织1.6 g,取生理盐水16 mL稀释,在冰水浴条件下,制成10%的组织匀浆液,3 000转/分在4 ℃离心10 min,取上清,利用购自于南京建成的考马斯亮蓝试剂盒测定每个组别的蛋白浓度．

1.4.2 抗氧化指标测定

取10%的胡萝卜愈伤组织匀浆上清液,分别测定总抗氧化能力(T-AOC)、GSH-PX活力、SOD活力、H2O2浓度和MDA含量,各种抗氧化指标测定试剂盒购于南京建成生物工程有限公司, 测定方法与计算公式严格按照试剂说明进行．

2 结果与分析

2.1 愈伤组织生长状况统计

图1A-D结果显示为胡萝卜形成层组织培养30 d后愈伤诱导的情况．不同组别的愈伤在培养30 d后大部分被诱导形成,但亚硒酸钠0.5 mg和1 mg试验组中愈伤组织出现的时间较早于无添加和亚硒酸钠2 mg组．亚硒酸钠0.5 mg和1 mg试验组愈伤组织出现于第二周末(14 d左右),亚硒酸钠2 mg和无添加试验组愈伤组织出现于第三周末(20 d左右)．

表1结果显示,MS培养基中添加亚硒酸钠后,胡萝卜愈伤组织的生长状况明显高于非添加组．添加组中0.5 mg/L和1.0 mg/L亚硒酸钠浓度的生长状况最佳,愈伤组织褐化低．其它两个组别生长状况较差且愈伤组织发生褐化高．

图1A 无亚硒酸钠添加组愈伤组织的诱导 图1B 亚硒酸钠0.5mg组愈伤组织的诱导

图1C 亚硒酸钠1 mg组愈伤组织的诱导 图1D 亚硒酸钠2 mg组愈伤组织的诱导

加入亚硒酸钠的浓度/mg/L00.51.02.0接种胡萝卜数/个26282726愈伤组织褐化[18]/个6347愈伤组织颜色白色橘黄色淡黄色淡黄色愈伤组织生长状况++++++++++++

注:“+”代表愈伤组织的生长状况．

2.2 胡萝卜愈伤组织的诱导率

表2结果显示,MS培养基中添加亚硒酸钠后,添加量为0.5 mg/L和1.0 mg/L的组对胡萝卜愈伤组织的诱导率均为100%,0 mg/L组为96.2%,添加量为2.0 mg/L的组愈伤组织的诱导率最低为92.3%．

表2 不同亚硒酸钠添加组对胡萝卜愈伤组织诱导状况的影响

2.3 亚硒酸钠的不同添加量对愈伤组织总蛋白含量的影响

注:不同大写字母者表示差异极显著(P<0. 01),不同小写字母者表示差异显著(P<0. 05),相同小写字母者表示差异不显著(P>0. 05),下表同．

不同浓度亚硒酸钠的添加量对愈伤组织总蛋白含量的影响结果见图2．在MS培养基中添加亚硒酸钠后总蛋白含量较空白组显著提高,其中亚硒酸钠添加量为0.5 mg/L和1 mg/L组中,总蛋白含量显著高于2 mg/L添加组(P<0.05)和极显著高于空白组(P<0.01),亚硒酸钠添加量为0.5 mg/L和1.0 mg/L组间差异不显著(P>0.05)．

2.4 胡萝卜愈伤组织抗氧化能力指标的检测定分析

2.4.1 亚硒酸钠的不同添加量对愈伤组织T-AOC含量的影响

由图3结果可知,添加亚硒酸钠后,随着亚硒酸钠浓度的升高T-AOC的含量先升高后降低,添加量为2.0 mg/L组中T-AOC含量最低,添加量为0.5 mg/L组中T-AOC含量最高,并且添加量为0.5 mg/L的组别T-AOC含量极显著高于0 mg/L和2 mg/L的添加组(P<0.05),显著高于1 mg/L的硒添加组(P<0.05)．

图2 愈伤组织总蛋白含量的比较

图3 愈伤组织T-AOC的比较

图4 愈伤组织GSH-PX活力的比较

2.4.2 亚硒酸钠的不同添加量对愈伤组织中GSH-PX活力的影响

图4结果显示,添加亚硒酸钠后,添加量为0.5 mg/L组中GSH-PX含量最高,添加量为2.0 mg/L组中GSH-PX含量最低,并且添加量为0.5 mg/L组别极显著高于添加量为0 mg/L和2.0 mg/L的组别(P<0.01),与1.0 mg/L的组比较差异显著(P<0.05)．

2.4.3 亚硒酸钠的不同添加量对愈伤组织中SOD活力的影响

图5 愈伤组织SOD活力的比较

图6 愈伤组织H2O2含量的比较

由图5结果可知添加亚硒酸钠对SOD含量的影响．添加量为0.5 mg/L组中SOD含量最高,且极显著高于其它组(P<0.01)．

2.4.4 亚硒酸钠的不同添加量对愈伤组织中H2O2含量的影响

图6结果显示,添加亚硒酸钠后,H2O2的含量呈下降趋势,添加量为0.5 mg/L组中H2O2含量最低,显著低于添加量为1.0 mg/L、2.0 mg/L的组别和0 mg/L添加组(P<0.05),添加量为1.0 mg/L、2.0 mg/L的组别和空白添加组别之间,H2O2含量差异不显著(p>0.05)．

2.4.5 亚硒酸钠的不同添加量对愈伤组织中MDA含量的影响

图7 愈伤组织MDA含量的比较

由图7结果可知添加亚硒酸钠对MDA含量的影响．添加量为0.5 mg/L组中MDA含量最低,显著低于添加量为1.0 mg/L的组别(P<0.05),且极显著低于2.0 mg/L与空白组(P<0.01)．

3 讨论

3.1 亚硒酸钠添加量对胡萝卜愈伤组织诱导的影响

愈伤组织是在无菌条件下,人工培养植物外植体形成的没有分化的一团薄壁细胞,它可以在适合的条件下分化产生出植物的各种器官和组织,进而发育成一棵完整的植株,是植物快繁的常用手段．愈伤组织在培养的过程中,组织褐变是植物组织培养中的一大难题,组织褐化的产物不仅使外植体及细胞产生褐变,而且对多种酶有抑制作用,严重褐化还会导致组织死亡．在本实验中,MS培养基中加入适宜的亚硒酸钠浓度时,胡萝卜愈伤组织生长状况得到改善,愈伤组织诱导率提高;反之,诱导率下降．实验结果显示,亚硒酸钠的添加量在0.5 mg/L和1 mg/L时,胡萝卜愈伤组织诱导效果最佳,组织发生褐化较少,诱导率均为100%,并且愈伤组织出现的时间较0 mg/L与2 mg/L添加组早．

3.2 亚硒酸钠添加量对抗氧化能力的影响

谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物歧化酶(SOD)是衡量组织抗氧化能力的重要指标[13]．GSH-PX的组成成分中含有硒,每摩尔的谷胱甘肽过氧化物酶中含有4 g原子硒,谷胱甘肽过氧化物酶通过催化还原性谷胱甘肽与过氧化物的氧化还原反应,从而清除组织内的氧自由基,保护组织不受氧自由基的损害．硒的添加影响了谷胱甘肽过氧化物酶的活性．由实验结果可知,加入的亚硒酸钠浓度为0.5 mg/L时,GSH-PX的活力最大,显著高于浓度为1 mg/L的组,极显著高于0 mg/L和2 mg/L的组,有效地提高了愈伤组织的氧化防御能力．

研究表明,添加合适浓度的无机硒或有机硒,可以提高GSH-PX的活性,进而影响氧自由基的含量,还会间接地影响SOD活力．SOD以氧自由基为底物,是体内清除氧自由基的首要物质,SOD活力高低可以作为反映组织衰老和死亡的直观指标[14]．SOD可以清除组织内的氧自由基如H2O2及氧自由基代谢终产物含量如MDA含量降低．因此,加入亚硒酸钠浓度为0.5 mg/L时,SOD活力最大,H2O2浓度最低,MDA含量最少,总抗氧化能力最高,愈伤组织的抗氧化能力最强．

试验结果可知,胡萝卜的形成层作为外植体可以有效利用亚硒酸钠,亚硒酸钠的添加浓度为0.5 mg/L时,愈伤组织诱导形成早且组织的抗氧化能力较高,对胡萝卜快繁体系的建立,贫硒地区的农业实践推广以及进一步培育出富硒,抗氧化能力更强的胡萝卜提供了理论指导．

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Effect of Sodium Selenite on the Induction of Carrot Callus

WU Xiaoying1, WANG Qing1, QIAO Hongping1,HAO Xuefeng1, WU Lihua1, HAO Caixia1, CAO Guidong2

(1.Department of Biology, Taiyuan Normal University, Taiyuan 030031;2.Shanxi Furuiwo Bioengineering CO.,LTD, Taiyuan 030012, China)

Fresh Carrot cambium selected as experimental materials to study the effect of sodium selenite on the induction of Carrot callus. Added the concentration of sodium selenite 0, 0.5, 1.0, 2.0 mg/L, respectively, into MS medium with 2.0 mg/L 2, 4-D and 0.8 mg/L 6-BA to observe the induction of callus, to calculate the induction rate of callus and to determinate the antioxidant capacity, namely, total antioxidant capacity, GSH-PX and SOD activity, H2O2and MDA concentration. The results show that the optimal concentration of sodium selenite added in MS medium is 0.5 mg/L. Carrot callus are induced effectively, growth condition of callus are improved, the antioxidant capacity of callus are significantly increased.

sodium selenite; callus; the antioxidant capacity

2016-08-07

国家自然基金(21307087)；山西省自然基金(2014011028-4).

武晓英(1973-),女,山西太谷人,博士,太原师范学院副教授,主要从事动物营养分子生物学研究.

1672-2027(2016)03-0091-06

Q657

A