正交优化知母黄酮超声提取工艺及抗氧化研究

郝晓华，高改利，曹丽蓉，原庭玉，巩瑞兰

(忻州师范学院 生物系，山西 忻州 034300)

知母(AnemarrhenaRhizome)：百合科植物,具较强抗旱抗寒能力，是荒原山区的重要绿化品种.知母根茎烘干切片后可入药，又称“地参”.植株可直接用于外感热病、清热镇咳、肠燥便秘[1]等症.根茎具有防止血小板凝集、解热、降低转氨酶活性等多种药理功能[2-4].黄酮类化合物(flavonoids)又名维生素P[5]，具很好的营养价值.其表现出良好的药理功能，如降低血液黏度、减少血栓的凝集和血脂的形成、抗氧化、防衰老、消炎、止痛、杀菌等[6-8]，是一种具有极大实际应用前景的天然抗氧化物.

知母中甾体皂苷类、多糖类、黄酮类等活性物质含量丰富[2].多数文献侧重于知母多糖类和皂苷类成分的提取分离与纯化，关于知母根茎中总黄酮提取工艺及其抗氧化活性研究目前还鲜有报道，因此，很有必要对知母中黄酮类物质的提取工艺与其抗氧化活性进行探究.

超声波辅助法是常用的提取细胞内容物的方法，具有省时、高效、低成本、简便等优点[9-10].本文通过正交法对提取条件进行优化，并对知母黄酮进行抗氧化性研究，为进一步地研究知母中总黄酮的功效以及合理利用知母药材资源与开发黄酮类制品提供部分参考.

1 实验材料及方法

1.1 实验材料

所用材料为知母根茎，2017年6月购自五台山大药房，干燥烘干，用组织粉碎机粉碎后过60目标准筛去除大颗粒性杂质备用.

1.2 仪器与试剂

AL204高精密电子天平：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；LC-4016低速台式离心机：安徽中科仪器有限公司；KQ3200DV超声波清洗器：浙江赛德仪器有限公司；723PC紫外-可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；SHB-III标准型双表循环水式真空泵：天津赛得利仪器有限公司.

芸香苷标准品：合肥博美生物科技有限责任公司；2,2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH)：北京酷尔化学科技有限公司；95%乙醇、七水合硫酸亚铁、水杨酸、亚硝酸钠、九水合硝酸铝、过氧化氢、氢氧化钠、抗坏血酸，超纯水，所用药品与试剂均为国产分析纯.

1.3 实验方法

1.3.1 芦丁标准曲线的绘制[11]

参照秦明有的方法，本实验中设置芦丁浓度为0-0.08 mg/mL等8个浓度梯度，5%亚硝酸钠-4%氢氧化钠-10%硝酸铝-70%乙醇混合液为反应显色剂并且当作对照溶液，在510 nm下测定吸光度OD值，每个浓度水平重复测定三次后取算术平均值.

1.3.2 知母总黄酮提取工艺流程

知母根茎→干燥→粉碎过筛→加入乙醇提取液→超声波提取→水浴→离心→二次提取→合并上清液减压抽滤并脱色→浓缩→定容→510 nm处测吸光值.

精密称量已干燥过筛的知母粉末1.00 g于500 mL烧杯中；按一定料液比加入一定体积的70%乙醇，超声波辅助浸提一定时间，后于70 ℃的水浴锅中加热0.5 h，4 200 r/min离心15 min取上清液，沉淀加提取剂重复上述步骤进行二次提取，合并上清液后加少量活性炭减压抽滤得黄酮提取液母液，用旋转蒸发仪将母液浓缩至50 mL，取2 mL加显色剂并定容至10 mL后于510 nm处测定吸光值.

1.3.3 总黄酮提取的单因素实验

按照1.3.2的方法，设置料液比(1:10～1:60g/mL)，超声提取时间(15～90 min)，超声功率(75～150 W)，超声温度(40～90 ℃)，考察它们对知母总黄酮提取率的影响，进行单因素试验时每个因素设置6个实验水平，每个水平重复测定3次取平均值.按照1.3.4节中的方法计算黄酮萃取率.

1.3.4 总黄酮提取率的计算

知母总黄酮提取率的计算公式：

提取率/%=(C×V1×V)/(M×V2)×10-3×100%

式中：C为黄酮质量浓度(g/mL)

V为母液总体积(50 mL)；

V1为待测液的体积(10 mL)；

V2为母液分取的体积(2 mL)；

M为知母粉末的质量(1.00 g).

1.3.5 知母总黄酮提取工艺的正交实验

根据单因素实验结果，分别从4个因素的6个水平中筛选出3个较优水平作为考察对象，开展优化实验.

用SPSS 20.0软件设计L9(34)正交实验，见表1.参照正交设计表中的组合进行提取实验，测定提取率，优选最佳组合.

表1 知母总黄酮提取工艺L9(34)因素水平表

1.4 抗氧化能力测定

1.4.1 DPPH·清除能力的测定

参照周宁[12]等人方法，将知母总黄酮提取液稀释成不同浓度梯度(5,15,25,35,45 μg/mL)的样品液，按下列组合分别加入各个试剂，混匀.按下式计算DPPH·清除率：

DPPH·清除率/%=[A0-(A-A1)]/A0×100%.

A:1 mL样液+3 mLDPPH溶液.

A1:1 mL样液+3 mL无水乙醇.

A0:1 mL蒸馏水+3 mLDPPH溶液.

将抗坏血酸配制成与总黄酮相同浓度梯度的样液，测定Vc的DPPH·清除率.

1.4.2 对羟基自由基(·OH)清除能力的测定

参考杨喆等的方法[13-15]，将总黄酮提取液稀释成一系列浓度梯度(2，4，6，8，10 mg/mL)的溶液，抗坏血酸配成相同浓度梯度的溶液.向试管中顺次加入各个反应液，充分混匀.按下列公式计算·OH清除率：

·OH清除率/%=[A0-(A-A1)]/A0×100%.

A：实验组吸光度.

A1：对照组吸光度.

A0：为试剂本底吸光度.

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线的绘制

图1 芦丁标准曲线

见图1，纵坐标为吸光度OD值，横坐标为黄酮质量浓度，得线性回归方程为y=12.907x+0.002 5，回归系数为R2=0.999 1的标准曲线.在浓度为0-0.07 mg/mL范围内线性关系良好.

2.2 单因素实验结果

2.2.1 料液比对提取率的影响

图2所示为料液比对黄酮萃取得率的影响.总黄酮提取率先升后降.这是因为随着料液比增大，细胞壁外渗透压升高，黄酮相对浓度降低，利于细胞中黄酮类物质的浸出，但料液比大于1∶40后，细胞内非黄酮类杂质溶出量增加，导致提取率下降，乙醇溶剂浪费.故选择1∶20，1∶30，1∶40这三个水平进行后续正交试验.

2.2.2 超声时间对提取率的影响

图3所示为超声时间对提取率的影响.总黄酮提取率随超声时间的增加变化趋势为先上升后下降.随着超声时间的延长，细胞破碎率和总黄酮溶出量都增加，到45 min时达到最大值，此时黄酮浸出率与杂质浸出率基本达到平衡.超过45 min后，由于超声波对黄酮结构有破坏作用，杂质浸出较多，目标产物提取率减小.且抽提时间过长易造成溶液粘稠度增大，抽滤难度增加，故选择30 min，45 min，60 min三个水平做正交试验.

图2 不同料液比对总黄酮提取率的影响图3 总黄酮提取率随超声时间的影响

2.2.3 超声功率对提取率的影响

图4所示为不同超声功率对提取率的影响.总黄酮提取率随着超声功率的增大逐渐上升，120 W以后黄酮溶出增加速率开始降低，此时超声功率对提取率的影响开始减弱.由于实验中仪器限制，最大功率只能达到150 W,故选择超声功率120 W，135 W，150 W作为正交试验的三个水平.

2.2.4 超声温度对提取率的影响

图5为超声温度对提取率的影响.总黄酮提取率随超声温度的升高先上升后下降，在40 ℃-60 ℃范围内，提取率上升较快，这是因为高温加快分子活动，使黄酮浸出速度加快.而大于60 ℃以后，提取率反而下降，这是因为某些黄酮类化合物的分子结构在过高温的环境中容易发生分解，且高温下多糖类物质分解速度和浸出速度加快，使细胞外液中杂质含量增多.所以选择50 ℃,60 ℃,70 ℃三个温度水平作正交试验.

图4 不同超声功率对总黄酮提取率的影响图5 不同超声温度对总黄酮提取率的影响

2.3 总黄酮提取工艺的正交设计及结果

依据单因素试验结果，以4因素料液比(A)、超声时间(B)、超声功率(C)、超声温度(D)为考察对象，设计正交试验表.正交设计及结果见表2，正交方差分析见表3.

表2 正交试验设计及结果

注：R的数值越大表明该因素的水平变动对试验结果的影响效果越明显.

表3 正交实验方差分析结果

注：P<0.01则表示极显著；0.010.05则表示不显著.

由正交试验结果表中R值可知，各因素对提取率的影响程度依次为：料液比>超声功率>超声温度>超声时间,因素A(料液比)的极差(R)高达0.97，其对知母总黄酮提取率的影响最大.因素C(超声功率)的极差是0.63，其对知母总黄酮提取率的影响较大.因素B(超声时间)和D(超声温度)的极差分别为0.29，0.32，它们对提取率的影响差不多，在4因素中较小.通过比较k值可知，因素A与因素C的水平3为最优，B与D的水平2最优.由方差分析表可知，液料比的P=0.007<0.01，对黄酮提取得率的影响极显著.超声功率的P值0.010.05，对黄酮得率没有显著影响.综合上述，可以确定总黄酮提取的最佳工艺条件为A3B2C3D2，即料液比1∶40 g/mL、超声时间45 min、超声功率150 W、超声温度60 ℃.对该实验组合进行检验以考察该工艺是否为最佳提取条件.

2.4 正交结果验证实验

准确称取知母粉末3份各1.00 g，按工艺条件A3B2C3D2进行实验测定提取率，重复测定3次，得提取率分别为1.52%，1.55%，1.53%.总黄酮提取率相近，无显著差异，且平均值1.53%高于正交设计表中的最高值，说明工艺稳定可靠，正交试验结果可信.

2.5 总黄酮抗氧化性结果

2.5.1 清除DPPH·实验结果

由图6分析可知，知母总黄酮对DPPH·具有显著清除能力，其对DPPH·的清除率随质量浓度的增大不断增强.虽然在相同条件下知母总黄酮对DPPH·的清除能力始终略低于同浓度的Vc，但当其质量浓度为25 μg/mL时清除率达50.7%，浓度为45 μg/mL时其清除率可达76.5%，其清除能力几乎等同于抗坏血酸.此后，清除率基本保持稳定.表明知母总黄酮对DPPH·有较好的清除作用.

2.5.2 清除·OH实验结果

由图7分析可知，知母总黄酮清除·OH的能力与质量浓度基本呈正相关，清除率随质量浓度的增大不断增强.总黄酮量为10 μg/mL时自由基清除率就可达到60.2%，在相同浓度下，总黄酮对自由基清除率的增加趋势与抗坏血酸的自由基清除率增加趋势基本相同，但总黄酮对·OH的清除能力始终低于抗坏血酸.

图6 知母总黄酮与抗坏血酸清除DPPH·能力比较图7 知母总黄酮与抗坏血酸清除·OH能力比较

3 结论

本实验采用超声波辅助乙醇溶剂法提取知母根茎中总黄酮，通过单因素和正交实验，确定最佳提取工艺.实验结果显示，总黄酮提取的最佳工艺条件为料液比1∶40 g/mL、超声时间45 min、超声功率150 W、超声温度60 ℃.该工艺下平均提取率达到1.53%，即提取量为15.30 mg/g.正交验证实验中，3次重复实验提取率分别为1.52%，1.55%，1.53%，相差不大，说明该正交结果稳定可靠.抗氧化能力测定实验中，随着黄酮质量浓度的增大，对DPPH·与·OH的清除能力都逐渐增强，其抗氧化能力与浓度基本呈正相关，虽与抗坏血酸相比其抗氧化性略差，但知母总黄酮仍具有良好的自由基清除能力.