茯苓菌丝体胞外多糖硫酸酯化工艺的研究

韩 勇

（山西药科职业学院，山西 太原030031）

茯苓是我国传统的中药材，具有渗湿、利尿、健脾等功效.茯苓多糖因具有调节机体免疫，抑制肿瘤生长等功能，而成为近年来研究较多的真菌多糖.

为提高多糖的生物学活性，将天然多糖进行硫酸酯化结构修饰已成为多糖研究的热点之一.众多研究发现，硫酸酯化多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、增强机体免疫功能等多种生物学活性[1－3].

本实验室通过液体深层发酵培养茯苓，获得茯苓发酵液，经检测，发酵液中含有大量茯苓菌丝体胞外多糖.目前，关于茯苓菌丝体胞外多糖硫酸酯化的研究报道较少，本文通过响应面试验研究了茯苓菌丝体胞外多糖硫酸酯化的工艺条件，为今后该多糖的生物学活性研究提供了实验依据.

1 材料与方法

1.1 供实验用样品

通过10L发酵罐进行液体深层发酵培养获得茯苓发酵液，经检测，发酵液中含有大量菌丝体胞外多糖.经提取纯化，得茯苓菌丝体胞外多糖.

1.2 主要仪器设备

752N紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），TGL20M－Ⅱ高速冷冻离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）.

1.3 茯苓菌丝体胞外多糖硫酸酯化条件的优化

采用氯磺酸—吡啶法制备茯苓菌丝体胞外多糖硫酸酯衍生物.在冰浴及搅拌的条件下逐滴将氯磺酸缓慢滴入吡啶中，配制成硫酸酯化试剂.

称取1g多糖溶于20mL甲酰胺，然后加入硫酸酯化试剂.反应液水浴加热至一定温度，并持续搅拌反应一定时间.反应停止后冷却至室温，加入预冷的蒸馏水中，氢氧化钠中和至中性，后加入3倍体积无水乙醇，析出沉淀.6 000r／min离心10min，收集沉淀，得茯苓菌丝体胞外多糖硫酸酯衍生物.

以硫酸基团取代度为检测指标，考察氯磺酸与吡啶摩尔比、反应温度和反应时间对多糖硫酸酯化效果的影响.通过单因素试验找出试验因素水平范围，经响应面试验确定最佳多糖硫酸酯化条件.

1.3.1 氯磺酸与吡啶摩尔比优化试验

将氯磺酸与吡啶以不同的摩尔比配制成硫酸酯化试剂，按1.3所述进行多糖硫酸酯化，其中，反应液水浴加热温度为70℃，持续搅拌反应3h.

1.3.2 反应温度优化试验

按1.3所述进行多糖硫酸酯化，其中，分别调节反应液水浴加热温度为50℃，60℃，70℃，80℃，90℃，100℃，持续搅拌反应3h.

1.3.3 反应时间优化试验

按1.3所述进行多糖硫酸酯化，分别持续搅拌反应1h，2h，3h，4h，5h.

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1.3.4 响应面试验

在单因素试验的基础上，采用Box－Behnken试验设计对多糖硫酸酯化条件进一步优化，运用响应面分析确定影响因素的最佳条件.

1.4 硫酸基团取代度检测

采用硫酸钡浊度法测定硫酸基团含量（S%），硫酸基团取代度（degree of substitution，Ds）按公式:Ds＝l.62×S%／（32－l.02×S%）计算[4].

2 结果与分析

2.1 多糖硫酸酯化单因素试验

2.1.1 氯磺酸与吡啶摩尔比优化试验

以硫酸基团取代度为检测指标，考察氯磺酸与吡啶以不同的摩尔比配制成的硫酸酯化试剂对多糖硫酸酯化效果的影响，结果见表1.

表1 氯磺酸与吡啶摩尔比对多糖硫酸酯化效果的影响

由表1结果可知，增加氯磺酸的比例，多糖可充分获得硫酸基，从而取代度明显提高，比例为1∶4时，取代度最高为1.02.当继续增加氯磺酸的比例，取代度反而有所降低，推测可能是反应液中酸度过高，导致了硫酸基的水解.

将氯磺酸与吡啶以1∶4的摩尔比配制成硫酸酯化试剂，按1.3所述进行多糖硫酸酯化，以硫酸基团取代度为检测指标，考察不同反应温度对多糖硫酸酯化效果的影响，结果见表2.

表2 反应温度对多糖硫酸酯化效果的影响

由表2结果可知，随着反应温度的升高，硫酸基团取代度明显提高，当反应温度超过70℃后，硫酸基团取代度开始下降.升高温度有利于硫酸酯化反应的充分进行，但温度升高超过一定程度后，多糖可能被降解，酯化反应受到抑制，从而硫酸基团取代度下降.因此确定反应温度为70℃.

2.1.3 反应时间优化试验

将氯磺酸与吡啶以1∶4的摩尔比配制成硫酸酯化试剂，反应液水浴加热至70℃，按1.3所述进行多糖硫酸酯化，以硫酸基团取代度为检测指标，考察不同反应时间对多糖硫酸酯化效果的影响，结果见表3.

表3 反应时间对多糖硫酸酯化效果的影响

由表3结果可知，随着反应时间的增加，硫酸基团取代度明显提高，当反应时间超过3h后，硫酸基团取代度开始下降.因此，确定反应时间为3h.

2.2 响应面优化多糖硫酸酯化条件

在单因素试验的基础上，以氯磺酸与吡啶摩尔比、反应温度和反应时间为自变量，硫酸基团取代度为响应值，对多糖硫酸酯化条件进行Box－Behnken优化试验，因素水平见表4，试验设计及响应值见表5，回归分析结果见表6.

表4 Box－Behnken设计因素水平表

表5 Box－Behnken试验设计及响应值表

表6 Box－Behnken试验设计回归分析结果

运用Design Expert软件对表5数据进行二次多元回归拟合，得回归方程:Y＝1.012＋0.053 75A＋0.06B＋0.118 75C＋0.05AB－0.042 5AC＋0.015BC－0.129 75A2－0.137 25B2－0.169 75C2.回归方程的决定系数R2为0.982 0，说明回归方程的拟合程度很好，预测值与实测值之间具有高度的相关性.回归模型显著可靠（P＜0.000 1），而失拟项不显著（P＞0.05），表明可以利用该回归方程确定最优的多糖硫酸酯化条件.

根据回归方程，作出不同因子的响应面分析图，见图1.响应面分析图直观的反映了各因素交互作用对响应值的影响.

图1 各因素交互作用的响应面分析图

由图1可知拟合曲面有最大值，通过岭脊分析[5]，得到最大值所对应的各因素的编码值:A＝0.204 8，B＝0.275 2，C＝0.336 6，通过Design Expert软件求解方程，得出多糖硫酸酯化优化的条件为:氯磺酸与吡啶摩尔比0.26即为1∶3.85，反应温度72.75℃，反应时间3.34h.该模型预测的取代度为1.05.考虑到实际操作，将硫酸酯化的最优条件修正为氯磺酸与吡啶摩尔比1∶3.85，反应温度73℃，反应时间3.34h.

2.3 Box－Behnken回归模型验证

为检验优化结果的可靠性，采用修正后的最优酯化条件进行多糖硫酸酯化验证试验，试验重复3次，结果取平均值，测得取代度为1.02，与模型预测值基本吻合，表明两者之间具有良好的拟合性，优化模型可靠.

3 结论

近年来，多糖的分子修饰和结构改造成为研究的热点，其中，硫酸酯化多糖以其诸多的生物和药理作用愈来愈引起人们的重视.但在硫酸酯化多糖的开发过程中，其硫酸酯化工艺条件的优化是关键.

本实验采用单因素及响应面试验法优化了茯苓菌丝体胞外多糖硫酸酯化的工艺条件，优化后的工艺参数为:氯磺酸与吡啶摩尔比1∶3.85，反应温度73℃，反应时间3.34h.

[1]魏建经，邵树军，王天元.硫酸酯化多糖化学及临床应用研究进展[J].中国生化药物杂志，1999，20（5）:260－262

[2]Katsuraya K，Nakashima H，Yamamoto N，et al.Synthesis of sulfated oligosaccharide glycosides having high anti－HIV activity and the relationship between activity and chemical structure[J].Carbohydr Res，1999，315:234－242

[3]Hattori K.Synthesis of sulfonated aminopolysaccharides having anti－HIV and anticoagulant activities[J].Carbohydr Res，1998，312:1－8

[4]Dodgson K S，Price R G.A note on the determination of ester sulfate content of sulphated polysaccharides[J].Biochem J，1962，84（1）:106－110

[5]曹小红，蔡 萍，李 凡，等.利用响应面法优化Bacillus natto TK－1产脂肽发酵培养基[J].中国生物工程杂志，2007，27（4）:59－65