2021 年天津市规模化奶牛场隐孢子虫病调查

刘莹/天津市动物疫病预防控制中心 300402

隐孢子虫（Cryptosporidium sp）是Tyzzer 于上世纪初（1907 年）在实验小鼠的胃肠道内首先发现的能引起人和多种动物腹泻的寄生原虫。隐孢子虫病是隐孢子虫感染引起的一种慢性、进行性、接触性传染病。隐孢子虫病潜伏期长，一年四季均可发生，无有效阻断措施和治疗措施，一旦感染往往难以治愈，只有淘汰根除。该病主要感染初生犊牛、哺乳犊牛和断奶犊牛，部分泌乳牛也可感染。该病在天津地区关注度较低，因此，规模牛场全面的检测的报道不多。经调研初步了解，本地区犊牛腹泻比较普遍，渐进性消耗较大，严重影响后期奶牛的产奶量。严重的导致犊牛死亡，危害严重。基于此，在天津市规模化牛场开展了该病流行率测量的横断面研究，为科学防控该病提供数据基础。

1 材料与方法

1.1 目标群天津市内存栏量1000 头以上的部分规模奶牛场。

1.2 抽样策略

1.3 调查对象研究类型是基于问卷调查和电话回访的横断面调查研究。选取天津市的4 个区，每区选一个牛场进行横断面抽样调查。

1.4 抽样策略与样本量的计算样本量计算公式为n=pq/(d/Zα)2，q=1-p，设允许误差d=0.1p，Zα 为显著性检验的统计量，当显著性水平α=0.05 时，Zα=1.96。根据文献设定我市奶牛场隐孢子虫感染率P 为28%，应采样本量约1000 份。

式中：n 为样本量；z 为置信区间相关的标准误差；p 为总体的估计差异性；q 为100-p；e 为相对误差。

1.5 病例定义隐孢子虫病阳性个体：经实验室隐孢子虫抗原ELISA 检测结果为阳性的牛只。

1.6 检测方法使用隐孢子虫粪便抗原ELISA 方法进行检测，该方法的敏感性(Se=95%)和特异性(Sp=96%)。出于经费考虑，实际检测过程中制作一份检测样品，结果代表样本结果，样品检测没有重复。

2 实验步骤

2.1 仪器设备微量可移动移液器及配套枪头；恒温培养箱；4℃冰箱；-20℃冰箱；计时器；记号笔；振荡器；酶标仪（含波长450mm 的滤光片）；去离子水或蒸馏水；洗板机。

2.2 试剂及样品制备洗涤工作液使用前，浓缩的洗涤液进行室温平衡（20℃～25℃），并混匀，（若有沉淀，最好在37℃很稳培养箱中加热5～10min，直至沉淀完全溶解），蒸馏水进行10 倍稀释，混匀。稀释液可4℃存放4 周。

企业应把培训工作纳入整体规划中，企业领导者应在战略上高度重视员工培训，“把培训工作当作一项长期的基础工作来抓，并将培训情况作为每个员工工作考核的重要内容”［3］。

样品处理：在2mL EP 管中加入2g 粪便样品，做好样品标记。加入1mL 样品稀释液，对稀释后的粪便样品逐份进行震荡混匀处理。静置样品，取上清液待检测。

2.3 实验步骤

（1）所有试剂在使用前进行室温平衡，使用涡旋振荡器对所有的试剂进行混匀；

（2）去除密封的抗原包背板，沿包装袋缺口处死开；

（3）取出所需量的微孔板固定与板架上，其余板条放入密封袋内保存。）记录样品位置。按照要求加入阳性对照，100μL/孔，阴性对照，100μL/孔，稀释好的样品，100μL/孔。每孔加入，100μL/孔 1 号酶结合物。用移液枪缓慢混匀孔中液体；

（4）盖上封板膜，室温孵育30min；

（5）洗板：小心去掉封板摸。洗板机进行3 遍洗板；

（7）每孔加入100μL 底物溶液，封板摸封死，室温避光孵育15min；

（8）终止液，50μL/孔，震荡混匀，在酶标仪450nm 读数，记录样品及阴性、阳性对照的吸光光度。

2.4 结果判定阴性对照OD＜0.2，阳性对照OD＞0.2 时试验成立。

表1 隐孢子虫粪便样品ELISA 检测结果判定标准

2.5 问卷调查设计针对养殖场/户的结构性问卷，内容包括牛场的生产管理、地理信息、历史疫情、传播相关风险因素等。田间调查和问卷填写由经培训的兽医人员统一进行。

3 数据处理和分析方法

应用Excel 进行数据汇总，应用Spss 进行数据统计。

4 结果

4.1 样本量选取天津市试验高水平较高的分布与不同区的四个规模牛场。四个场分别位于宝坻区、静海区、宁河区、滨海新区。并于抽样前2 周电话确定抽样框共4 家。共采集1000 份样品。由于经费有限，处理并检测样品1000 份。

4.2 个体流行率隐孢子虫是一种重要的人畜共患寄生性原虫。隐孢子虫感染各阶段奶牛，是引起犊牛腹泻的重要诱因。小牛临床感染的特征是淡黄色腹泻伴脱水、厌食和酸中毒。食欲减退、消瘦，易继发细菌感染而死亡。

检测样本1000 份，阳性样本123 份，个体表观流行率12.3%。根据个体诊断实验的敏感性(Se=95%) 和特异性(Sp=96%)，计算个体真实流行率为9.1%(CL95%,7.3%～10.9%)。

图1 真实流行率图示

图2 各场样品隐孢子虫检测阳性率

表2 各场样品检测隐孢子虫阳性率和真实流行率

图3 各场哺乳犊牛阳性率

表3 各场哺乳犊牛样品检测隐孢子虫阳性率和真实流行率

图4 各场断奶犊牛阳性率

表4 各场断奶犊牛样品检测隐孢子虫阳性率和真实流行率

图5 各场哺乳犊牛阳性率

表5 各场样品检测隐孢子虫阳性率和真实流行率

4.3 空间分布抽样的4 个区的规模化场全部为阳性场点。因经费和抽样点数不足，另有其他区县未涉及。因此，本项目未涉及的区县也无法排除阳性场点的存在。因此，本次初步调查无空间分布证据。

图6 阳性场群的空间分布

被调查的四个规模化养殖场，经检测全部为隐孢子虫阳性场。其中，A 场的阳性率最高，D 场的阳性率最低。

4.4 群间分布检测结果可见，哺乳犊牛的阳性率为22.33%，阳性率最高。其次为泌乳牛9.66%，断奶犊牛4.63%，青年牛和干奶牛的检测阳性率为0 。

图7 不同阶段牛阳性率

表6 不同牛群样品检测隐孢子虫阳性率和真实流行率

5 分析与讨论

本次规模化奶牛场隐孢子虫病初步调查，采取分层随机抽样的方法，抽取四个区的4 个规模化奶牛场，共采集、处理、检测样品1000 份。被检测场均有奶牛隐孢子虫阳性样本。可以推测隐孢子虫在我市规模化奶牛场中已经具有一定的污染面。推测牛群隐孢子虫感染比较普遍，场群流行率比较高。

根据个体表观流行率12.3%，诊断实验的敏感性(Se=95%)和特异性(Sp=96%)，规模化奶牛场的隐孢子虫的阳性率为9.1%(CL95%,7.3%～10.9%)。其中，哺乳犊牛的检测阳性率最高22.33%，真实流行率为20.1%(CL95%,16.3%～23.9%)。

根据初步调查结果可见，隐孢子虫在规模化牛场的感染比较普遍，调查品种均为荷斯坦牛，各年龄段均可发病，其中以犊牛感染率相对较高，其次为断乳牛。

结果提示A 场的哺乳犊牛阳性率远高于其他三个规模场。根据问卷调查结果，发现A 场于采样前2 个月引进一批待产奶牛，来源复杂。生产犊牛造成隐孢子虫阳性率显著高于其他规模场哺乳犊牛群体。因此，盲目引种混群是A 场犊牛腹泻严重，且隐孢子虫感染率高的主要原因。