羊布鲁氏菌病不同血清学检测方法的比较

李而珍 黄觉 李志贤 虞与理

（广西贺州市动物疫病预防控制中心，广西贺州 542899）

1 前言

羊布鲁氏菌病又被称为布病，它是由布鲁氏菌引起的人畜共患的一种慢性传染病，主要侵害生殖系统。羊感染后，以母羊发生流产和公羊发生睾丸炎为特征，主要有发热、流产、睾丸炎症、关节肿胀等症状。该病分布很广，除了危害羊之外，不仅感染各种家畜，而且易传染给人，危害人类的身体健康。为了更好的防范该种传染性疾病的传播流行，需要做好妥善的疫苗免疫接种工作和疫情的检测筛查。在羊布鲁氏杆菌病诊断过程中常用的检测方法，主要包括了虎红平板凝集试验、试管凝集试验、竞争ELISA抗体检测等。

某市对某羊场进行布病日常监测，采集了20份血液，检出4份阳性。某市对该羊场进行了全场采样，并通过对该羊场进行流行病学调查分析，对附近与该羊场有配种、放牧等接触的21个羊场也进行了全场采样，共采集新鲜血液1745份，将其放置在4℃的温箱当中进行保存，在试验操作过程中，首先对采集到的血液进行血清分离得到的血清进行编号处理（编号1-1745），然后进行血清学检测，研究不同学清学检测方法对布鲁氏杆菌病的检测效果。

2 虎红平板凝集试验

按照布鲁氏杆菌诊断技术标准进行（GB/T18646-2002动物布鲁氏菌病诊断技术 虎红平板凝集试验），在检测过程中主要涉及到的试剂为虎红平板凝集试验抗原和阴阳性对照血清，在玻璃板上各格标记受检血清号，然后加受检血清30μL，在受检血清旁滴加抗原30μL，用牙签类小棒搅拌血清和抗原使之混合，同时做阴阳性对照血清，在4min内进行判定，在阴、阳性血清对照成立的条件下，对被检血清进行判定，出现肉眼可见凝集现象者判为阳性（+），无凝集现象，呈均匀粉红色者判为阴性（-）。经检测1745份羊血清，103份为阳性，1642份为阴性。

3 试管凝集试验

按照布鲁氏杆菌诊断技术标准进行（GB/T18646-2018动物布鲁氏菌病诊断技术 试管凝集试验），在检测过程中主要涉及到的试剂为布鲁氏杆菌试管凝集试验抗原和阴阳性对照血清、0.5%石炭酸的10%氯化钠溶液，毎份血清用4支凝集试管，分别加入稀释液、阴阳对照血清、受检血清，从第1至第4管依次做稀释，血清稀释度分別为1：12.5、1：25、1：50、1：100，将稀释好的抗原液500μL分别加人已稀释好的各管血清中，羊血清稀释度则依次变为1：25、1：50、1：100、1：200，并做抗原对照和参照比浊管，将加样后的试管置温箱（37℃±1℃）孵育18～24h。

凝集反应程度应根据参照比独管来判读，分别记为“++++” “+++”“++”“+”“-”。++++菌体完全凝集，100%下沉，上层液体100%清亮；+++菌休几乎完全凝集，上层液体75%清亮；++菌体凝集显著，液体50%清亮；+有凝集物沉淀，液体25%清亮；-无凝集物，液体均匀混浊。当阳性对照血清出现完全凝集（++++），阴性对照血清无凝集（一），抗原对照无自凝（一）现象时，试验成立。结果判定：1：50血清稀释度，出现“++”及以上凝集现象时，判定为阳性，1：25血清稀释度，出现“++”以上凝集现象时，判定为可疑。将虎红平板凝集试验筛选出的103份阳性血清进行试验，如下表（其中10份）：

经判定76份血清在1：50血清稀释度，出现“++”及以上凝集现象，判定为阳性；21份血清在1：25血清稀释度，出现“++” 以上凝集现象，判定为可疑；6份判定为阴性。

4 竞争ELISA抗体检测

按照羊布鲁氏菌病抗体检测试剂盒（EILSA）中的相关说明进行严格的操作，在检测过程中主要涉及到的试剂为布鲁氏菌竞争抗体、酶标抗体、布鲁氏菌阴阳性对照血清、底物溶液、终止液等，每孔加入40uL工作浓度的洗涤液，分别在对应孔中加入阴阳性对照血清和受检血清，每孔加入50uL的竞争抗体混匀，37℃孵育60min，拿出抗原包被板甩干孔中的液体，每孔加入300ul工作浓度的洗涤液，洗涤3次，拍干后每孔加入100uL的酶标抗体，37℃孵育30min，按上步骤再次洗涤后，每孔加入50uL底物溶液A，再加入50uL底物溶液B，37℃避光孵育10～15min，每孔加入50uL的终止液终止显色反应，使用酶标仪测定450nm波长处的OD值。将虎红平板凝集试验筛选出的103份阳性血清进行试验，经检测103份血清的OD值，如下表：

结果判定：阴阳性血清和受检样品的平均OD值分别为ODNC、ODPC、ODS，阳性血清抑制率=（ODNC-ODPC）/ODNCx100%，样品抑制率=（ODNC-ODS）/ ODNCx100%。ODNC值应>0.5且阳性血清抑制率应>60%，试验结果有效，否则重新进行试验。样品抑制率≥50%判为阳性，样品抑制率<50%判为阴性。经计算阳性血清抑制率为89.9%（表1）、89.5%（表2），试验结果有效，对103份受检样品进行计算，102份为阳性，1份为阴性。

表1

表2

5 讨论

三种试验检测结果统计，如下图：

以上三种试验在操作过程中，不同的试验有着不同的诊断技术操作标准，检测的精确性也存在一定差异，同时也存在人为对试剂配制和操作的因素，特别是试管凝集试验在操作过程中相对比较复杂，整个试验过程相对较长，在进行结果判定过程中很容易受到相关人员的主观因素影响而出现较大的误差。在试验操作过程中应按照诊断技术标准进行严格的操作。

虎红平板凝集试验主要是快速凝集反应，更适合流行病学的筛查，用于检测动物是否感染布鲁氏菌病。试管凝集试验和竞争ELISA抗体检测，主要应用于感染动物的临床诊断及布鲁氏菌病的确诊诊断。试管凝集试验，用时较长，操作相对较复杂，结果可疑的家畜还需经30d后采血重检，但是凝集试验除了判定阴阳性，还能判定血清的抗体滴度。竞争ELISA抗体检测，是一种特异性较强的检测手段，并且灵敏度较高，操作较为简单，一次性能够完成大量样本的检测。诊断布鲁氏菌病的标准是找到病原体，但是布鲁氏菌的血培养或者骨髓培养的阳性率是有限的，更多依赖的就是免疫学方面的检测。在进行布鲁氏菌病抗体检测过程中，三种试验都是当前阶段采用的方法，每种方法各有优缺点和适用性，通过实验检测，一般还要结合患者的流行病学病史来综合考虑是否患有布鲁氏菌病。