口蹄疫灭活疫苗保存及稳定性研究

刘国民 高日明 尚策 宋庆庆 王凯 陈炳全 朱修泽/金宇保灵生物药品有限公司 010030

口蹄疫灭活疫苗中完整口蹄疫病毒粒子（146S）是重要的免疫抗原，其含量、完整性、稳定性决定了疫苗的免疫效果。口蹄疫病毒是无囊膜病毒，对氯仿不敏感，对温度、酸碱度比较敏感，当pH 变化或温度升高时完整病毒146S容易分解。完整的口蹄疫病毒粒子一旦裂解，疫苗的免疫效果将大幅度降低。生产中如何保护146S 抗原完整性以及保证疫苗纯度是工艺攻关难点。完整病毒粒子配合优质佐剂，刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞，进而保护易感动物不被口蹄疫病毒感染，最终使口蹄疫灭活疫苗起到防控疫病的作用。

疫苗生产是系统工程，包括细胞培养、病毒放大生产、纯化浓缩、分装乳化、保存、使用等工序。临床使用时，合格的疫苗必须具备安全、高效、均一、稳定的特性。生产过程中采用合理的保存温度和浓度，有助于延长病毒的保存期和维持较高的抗原水平，对生产中抗原的保存具有重要意义。本文通过对不同毒株热稳定试验、半成品不同温度、浓度下146S 变化、同时通过成品疫苗保存期试验及挑战试验等证明不同的口蹄疫毒株对温度敏感性不同，半成品、产品疫苗对温度、酸度比较敏感，2℃～8℃是疫苗最佳保存条件，本文章研究结果对疫苗稳定性方面研究有一定指导作用。

1 材料

1.1 口蹄疫毒株病毒液分别收集培养好的A/WH/09 毒株培养液、O/MYA98 毒株培养液、OR/80 毒株培养液及OZK/93 毒株培养液，各取1000mL 备用。

1.2 口蹄疫半成品原液及浓缩液A/WH/09、O/MYA98 口蹄疫灭活半成品抗原各1000mL，由金宇保灵公司生产部提供。

1.3 口蹄疫成品灭活疫苗OA 型口蹄疫灭活成品疫苗（20瓶）由金宇保灵公司生产部提供。

2 方法

2.1 不同口蹄疫毒株热稳定性试验将A/WH/09 毒株、O/MYA98 毒株、OR/80 毒株及OZK/93 毒株病毒样品，先进行批量解冻，将毒液分装成10mL 离心管12 只，将不同口蹄疫毒株在90℃热水浴锅中灭活1min～8min，检测TCID50，并记录数据，主要观察口蹄疫毒株对温度的敏感性。

2.2 口蹄疫半成品在不同温度和浓度条件下146S 影响试验随机抽取本公司生产部灭活抗原液及其相应批号的10倍浓缩纯化液，分别取样进行初始样品146S 含量的测定；将原液样和10 倍浓缩后样分别分装，20mL/瓶，每种样品分2 组，分别在-20℃和4℃冰箱中保存7 个月，每月定期各取出1 个样品分别进行146S 的测定。

2.3 口蹄疫成品灭活疫苗保存期试验及反复冻融挑战试验将同批次的20 瓶OA 型口蹄疫灭活成品疫苗分成两组，一组2℃～8℃保存12 个月，每月抽检一瓶；另一组做-20℃挑战试验，保存8 瓶并反复冻融5 次，冻融后检测抗原含量。

3 结果

3.1 不同口蹄疫毒株热稳定性 从表1 数据可知，口蹄疫不同毒株对热稳定性有差异

表1 90℃热水浴对不同口蹄疫毒株稳定性试验（TCID50）

3.2 口蹄疫半成品在不同温度和浓度条件下146S 影响从表2 数据可知，口蹄疫半成品在4℃和-20℃保存的7 个月中，完整病毒146S 粒子的含量均有所下降。4℃保存条件下，原液样和浓后样完整病毒146S 粒子的降解率分别为27.5%、12.3%；-20℃保存条件下，其降解率分别为87.5%、92.4%。从本试验数据证明，4℃比-20℃保存条件更有利于抗原的保存，浓度对抗原保存影响不显著。3.2 口蹄疫成品灭活疫苗保存期试验及反复冻融挑战试验结果

表2 口蹄疫半成品在不同温度和浓度条件下对完整病毒146S检测结果（ug/mL）

从图1 数据可知，口蹄疫 A 型、O 型灭活疫苗在2℃～8℃分别放置 12 个月，每月采用蔗糖密度梯度离心定量法检测146S 含量，结果发现，146S 抗原含量基本没有变化,说明疫苗有效抗原保存比较好，完整病毒粒子保存完整。

图1 口蹄疫成品疫苗2℃～8℃保存12月146S 含量变化（μg/mL）

从图2 数据可知，将口蹄疫灭活疫苗多次冷冻融化后，抗原含量降解比较多，每次反复冻融抗原损失10～20%左右，5 次反复冻融后，抗原损失50%左右，因此在保管疫苗时尽量不要冻融。冻融后的疫苗坚决不能使用，因为完整病毒粒子146S 已经裂解为无效的12S 五聚体。

图2 口蹄疫O 型、A 型灭活疫苗反复冻融后146S 抗原含量变化（μg/mL）

图3 口蹄疫衣壳蛋白在存储、加热、低pH 条件下，完整病毒粒子146S 裂解成12S 五聚体电镜图

4 讨论

稳定的抗原、有效的佐剂是疫苗研究的重点和难点。灭活疫苗在长期储存、加热和微酸性环境中，病毒颗粒极其容易裂解，裂解产物也被称为12S，12S 是一个由VP1，VP2，VP3组成的五聚体。因为五聚体之间存在大量的组氨酸残基，在酸性环境下组氨酸会迅速发生质子化，释放正电荷，通过静电排斥作用引发粒子裂解，这是口蹄疫不稳定的原因。由于146S 粒子在酸性环境下分解成12S 粒子，而12S 表面的免疫反应位点被隐藏或发生形变的缘故，使12S 不具备任何免疫原性，无法激发产生抗体，降低口蹄疫疫苗的免疫效力。口蹄疫病毒会在高温状态下，使组合状态的 12S 粒子转化为分解状态，因此口蹄疫病毒不宜长期暴露在高温状态下，口蹄疫疫苗效力与口蹄疫灭活疫苗中的 146S 粒子数量有关，若是能够确保 146S 粒子稳定不被分解，口蹄疫疫苗的效力就能到有效的保护，这也是口蹄疫灭活疫苗2℃～8℃保存的机理。口蹄疫抗原稳定性差给口蹄疫疫苗的生产、储存和应用带来了很多困难，使用过程中必须全程冷链运输以保护口蹄疫的免疫原性。

口蹄疫病毒抗原对酸和热极其敏感，为了保证疫苗质量，生产商采取研发疫苗抗原保护剂、增加昂贵的冷链运输系统、将优质疫苗送到用户手中。如何保障疫苗抗原不降解或降解速率慢，是疫苗生产企业的难点，但金宇生物一直采用自主研发的UTM 保护剂，从工艺技术上保障疫苗稳定性，从运输环节上采用无死角的2℃～8℃冷链运输，使客户用上最好、最新鲜的疫苗。不论后续技术如何革新，口蹄疫病毒粒子的完整性和稳定性研究，一直是广大科技从业者长期努力和研究的方向。