一株仔猪腹泻致病性大肠杆菌的分离鉴定

陈亮 刘雪松 黄思琪 张蕾 冯万宇 李丹 兰世捷 苗艳 沈思思 黄宝银 史同瑞*

1.黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院 161005

2.东北农业大学动物医学学院 150030

大肠杆菌可以引起仔猪的腹泻，根据猪的日龄以及和致病性大肠杆菌的血清型不同，可以将仔猪腹泻疾病分为仔猪黄痢、仔猪白痢以及仔猪水肿病等。引起仔猪腹泻大肠杆菌的致病因子较多，包括了黏附素和肠毒素等。在仔猪腹泻大肠杆菌中常见的黏附素为K88、K99 以及987P 等。致病性大肠杆菌可以通过黏附素的黏附作用让大肠杆菌定居在小肠上皮上，大量繁殖并分泌肠毒素，从而影响动物机体的水分吸收排泄平衡，造成腹泻。

2020 年10 月黑龙江齐齐哈尔市周边某猪场发生仔猪腹泻症状，对该猪场病死仔猪进行剖检，将无菌得到的病料进行细菌的分离鉴定，测定其含有的毒力基因，并通过药敏试验指导临床用药。

1 材料

1.1 病料无菌采集腹泻仔猪病料，包括肝脏、脾脏以及小肠等。

1.2 试剂伊红美蓝琼脂培养基，北京索莱宝科技有限公司生产。麦康凯琼脂培养基，山东拓普生物工程有限公司生产。MH 培养基，青岛海博生物技术有限公司生产。50×TAE，北京拓奥达科技有限公司生产。革兰氏染色液，常德比克曼生物科技有限公司生产。药敏纸片，杭州滨和微生物试剂有限公司生产。Taq Master Mix，南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产。DNA Marker，大连Takara 公司生产。

2 方法

2.1 病原菌分离培养将病料无菌接种到鉴别培养基中，观察菌落形态，显微镜下观察细菌形态。

2.2 黏附素毒力基因检测根据相关参考文献，合成相应毒力基因，以细菌菌液为模板提取DNA 进行扩增。毒力基因引物序列如表1 所示。

表1 黏附素毒力基因引物序列

2.3 药敏试验药敏试验采用CLSI 指导进行。将细菌培养到1.5×108CFU/mL，均匀涂抹于MH 琼脂平板上，将药敏纸片均匀安放在平板上，培养过夜后观察结果。

3 结果与分析

3.1 腹泻仔猪剖检结果腹泻仔猪剖检结果如图1 所示，可以看出腹泻仔猪出现小肠积气、肠出血以及卡他性肠炎症状。

图1 腹泻仔猪解剖图

3.2 细菌分离鉴定及毒力基因检测从病料中分离出来的细菌在伊红美蓝琼脂培养基上菌落呈现带金属光泽、边缘整齐、光滑湿润的菌落。在麦康凯培养基上呈现粉红色菌落。通过革兰氏染色镜检后发现分离得到的细菌为革兰氏阴性杆菌，多散在，两端钝圆。可以确定为分离的细菌为大肠杆菌。毒力基因检测结果如图2 所示。经过试验发现，该株细菌携带K99 毒力基因，为产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）。

图2 毒力基因检测结果

3.3 药敏试验结果通过药敏试验发现该株细菌对左氧氟沙星、阿米卡星、头孢曲松以及头孢哌酮具有敏感性，对于四环素以及环丙沙星耐药，对于庆大霉素处于中介状态。

4 讨论

引起仔猪腹泻的多为产肠毒素性大肠杆菌。其中猪源的产肠毒素性大肠杆菌经常携带的黏附素为K88、K99 以及987P 等。

猪大肠杆菌性腹泻病的预防最主要的手段之一便是疫苗免疫。多种因素会影响最后仔猪获得的免疫效果。卵黄抗体有着效价高、获取量大以及性价比高的特点。最重要的是卵黄抗体粉可以直接作为饲料添加剂为仔猪提供主动免疫力。路桂霞将K88、K99、987P 和F41 黏附素作为免疫抗原，制备出了抗仔猪大肠杆菌病卵黄抗体，并进行了临床试验，发现该种特异性卵黄抗体对仔猪大肠杆菌病具有良好的防治效果。刘文鑫对大肠杆菌K88、K99 天然菌毛及表达蛋白卵黄抗体进行了制备及初步应用，发现制备的卵黄抗体可与相应的大肠杆菌发生特异性凝集，并对仔猪黄、白痢具有良好的防治作用。