ET－743，现代海洋药物研究的成功典范

丁肇卫，汤 华，张 文＊

(1.山东中医药大学外国语学院英语系，济南250355；2.第二军医大学药学院海洋药物研究中心，上海200433)

[本文编辑] 姚春芳

海洋中蕴藏着丰富的生物资源，也包括许多人类至今尚未触及的未知领域。由于海洋生态环境的特殊性(高压、高盐、缺氧、避光)，使得各种海洋生物物种之间的生存竞争非常激烈，迫使很多海洋生物产生一些结构特殊、生物活性显著的次生代谢物质，以便在严酷的生态环境下繁衍生存。这些次生代谢产物成为药源性活性物质的重要源泉。

现代海洋药物的研究可以追溯到20世纪50年代初期海绵核苷及海绵尿苷的发现[1]，这直接导致了现在临床上仍然在使用的阿糖胞苷和阿糖腺苷的上市。20世纪60年代末，随着“向海洋要药”口号的提出以及前列腺素从柳珊瑚中的发现[2]，海洋作为药源活性物质的巨大潜力已得到广泛认知，从而掀起了第一次海洋天然产物化学研究的高潮。但由于海洋天然产物分子骨架往往新颖奇特、十分复杂，而且化合物在生物中的含量很低，从而给结构解析与确定带来了相当大的困难，所以研究进展一度相当缓慢。到了20世纪80年代，现代波谱学、现代色谱学和现代分子生物学技术的迅猛发展，使海洋天然产物研究的高效、精细、目标化和生态化成为可能。由此，以生物活性为先导的对于海洋生物化学成分的研究揭开了新的篇章。

ET－743(图1)是从加勒比海鞘(图2)中分离得到的一种四氢异喹啉生物碱类化合物Ecteinascidin 743的简写。最初由西班牙Pharm Mar公司研发，后授权给美国强生及旗下强生制药研发公司。2007年7月已被欧盟人用医药产品委员会(CHMP)批准上市销售，用于治疗难控制的软组织肉瘤，商品名Yondelis(Trabectedin)。ET－743从发现、研究到上市，历经了现代海洋药物发展的全过程，生动体现了现代科技发展对于生产力的巨大推动作用，成为现代海洋药物研究的成功典范。

1 ET－743的发现

图1 ET－743的分子结构示意图Figure 1 Schematic molecular structure of ET－743

图2 加勒比海鞘Figure 2 Caribbean tunicate Ecteinascidia turbinate

早在1969年美国国家癌症研究会在对抗癌活性物质进行广泛筛选的过程中，发现海鞘的提取物显示较强的抗癌活性[3]。其后不断有人对此进行研究，但由于当时的技术水平无法满足对活性物质的分离和结构鉴定要求，最终均一无所获。直到1986年，伊利诺伊斯大学的Rinehart小组从海鞘分离得到6个具有显著细胞毒活性的单体成分ET－729、ET－743、ET－745、ET－759A、ET－759B 和 ET－770[ET后的数字代表当时经快速原子轰击质谱测定法(FABMS)测得的各化合物的分子量]。其中，ET－743得率最高(约为0.000 1%)，其体外对小鼠白血病肿瘤细胞株L1210的IC50值可达0.5ng／ml，体内对P388白血病小鼠的有效作用浓度可达15μg／kg，显示出良好的抗肿瘤活性。1990年，随着现代波谱学技术的发展，借助于新的技术，特别是二维核磁共振技术的帮助，Wright及Rinehart两个小组同时确定了ET－743的分子是一类具有四氢异喹啉骨架的生物碱结构，ET－729、ET－745、ET－759A、ET－759B和ET－770五个结构类似物的结构也一并得到确定[4，5]。ET－743的结构随后得到了单晶X－衍射的确认[6]。

2 ET－743的药理学研究

研究表明，ET－743具有很强的抗肿瘤活性。体外活性测试表明，ET－743对包括白血病、黑素瘤、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、软组织肉瘤、结肠癌、卵巢癌、直肠癌、肾癌、非小细胞肺癌及前列腺癌等肿瘤细胞都显示了良好的抑制活性[7，8]。其药理活性远远高于目前临床上广泛使用的抗肿瘤药物，如紫杉醇、喜树碱、多柔比星(阿霉素)、丝裂霉素、顺铂、博来霉素及依托泊苷等。ET－743与多柔比星等抗肿瘤药物显示协同作用。ET－743与多柔比星、三甲曲沙及紫杉醇联合用药对纤维肉瘤(HT－1080)和脂肪肉瘤(HS－18)细胞的活性比ET－743单独用药活性显著增强[9]。体内研究表明，腹腔及静脉给药时，ET－743可显著提高多种肿瘤裸鼠模型的生存率，包括白血病、黑素瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌等，疗效具有良好的剂量相关性，未发现药物致死现象。实验表明，间歇治疗效果明显优于分别连续给药治疗，ET－743对接种顺铂耐药的卵巢癌细胞的裸鼠也显示有效[10]。

对于软组织肉瘤，ET－743的活性作用在Ⅰ期临床试验中就显现出来[11]。在ET－743正式用于该组织疾病的试验之前，一项来自Ⅰ期试验和酌情使用ET－743的汇总分析，报告25例软组织肉瘤病人中有14例在使用ET－743之后，病情得到了控制[12]。在Ⅱ期临床试验中，ET－743被用于治疗卵巢癌、直肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤和间皮瘤等多种类型的癌症，而治疗效果最显著的是软组织肉瘤、乳腺癌和卵巢癌[13，14]。在3项包括189名先前接受过治疗的软组织肉瘤病人的Ⅱ期临床研究数据表明，ET－743能使50%的病人产生抗癌应答，使其病情稳定，中位生存期为10.3个月，19.8%的病人无进展生存中位数为6个月，29.3%的病人生存期在2年以上。ET－743对其他化疗药物，如多柔比星和异环磷酰胺无效的病人也有效。ET－743能被病人很好地耐受，剂量限制毒性(dose－limiting toxicity，DLT)不累积、可逆和可控，不同于其他细胞毒药物的是其没有心脏和神经毒性，秃头症也很少[15]。其他最新临床数据也证实，ET－743治疗软组织肉瘤疗效显著，能提高病人的生存率[16，17]。在Ⅲ期临床实验中，ET－743被用于治疗软组织肉瘤和卵巢癌[18]。欧盟和美国FDA已先后认同ET－743(商品名Yondelis)是治疗软组织肉瘤和卵巢癌的罕见药物。

ET－743的抗肿瘤活性涉及多重作用机制，主要是通过在DNA的复制过程中使DNA双螺旋小沟处鸟嘌呤的N－2烷基化，从而阻断DNA的复制和合成，抑制肿瘤细胞分裂生长[19，20]。另外，ET－743的抗肿瘤作用机制还涉及抑制遗传修复途径[21，22]、干扰细胞周期而导致p53依赖性的细胞程序化死亡[23，24]、扰乱肿 瘤 细 胞 微 管 网 络[25]、在 DNA 和 拓扑异构酶Ⅰ之间引起交联[26－28]等。对 ET－743药理活性及作用机制深入系统的研究，表明ET－743是一个良好的新药先导化合物，为其成药性研究奠定了坚实的基础。

3 ET－743的化学研究

ET－743复杂的特异性结构及良好的抗肿瘤活性引起了化学界及药理学界的广泛关注，激发了人们对相关类似化合物研究的极大兴趣。一方面，以Rinehart为首的课题组继续从天然来源中获取ET－743的类似物，并对这些类似物的生物活性进行广泛的抗肿瘤系统研究，企图寻找得到活性更好的有机分子。经过不懈的努力，他们先后得到了ET－722、ET－736、ET－734－N12氧 化 物[6]、ET－594、ET－597、ET－583、ET－596[7]等一系列结构类似物，但其肿瘤细胞毒活性仍然以ET－743为最好。

由于ET－743在海鞘中的含量极低，仅达生物体重的百万分之一，所以其化学合成研究就显得十分重要和迫切。为了解决药效实验过程中对药物的需求问题，合成化学家对ET－743的合成工作进行了大量的努力和探索，先后有4个课题组完成了对ET－743的全合成工作。1996年，Corey课题组首次报道了对ET－743的全合成工作[29]，主体反应是在巧妙地运用Strecker反应和分子内Mannich反应两个经典化学反应的基础上，经过40多步反应完成的，总收率0.53%。该反应的优点在于通过分子内Mannich环合反应，一步反应同时构建C、D两环，形成五环结构，但由于两个前体化合物的合成非常繁琐，限制了该方法的应用。2002年，Endo等[30]报道了ET－743立体专一性全不对称合成研究，整个路线也经历了40多步反应，总收率达到0.78%。他们通过四组分Ugi缩合反应、分子内Heck反应及随后酚－醛环化得到五环结构。该路线是按照CD－B依次完成对环结构的构建工作[30]。第3个全合成的研究报道完成于2006年，构环顺序为D－CB，反应过程大大缩短，只有31步，总收率也进一步显著提高，达到了1.7%[31]。同年报道的另一个全合成反应的构环次序为B－C－D，C、D的成环反应主要是通过分子内Pictet－Spengler反应得以实现，但该步反应收率较低，仅42%～58%[32]。另外，还有一些未完成的全合成研究[33－36]，这些研究在五元环骨架的构成、芳环及其他功能基团的修饰方面都进行了有益的探索。但总体而言，化学合成反应的步骤较为繁琐，反应要求的条件无法达到工业化生产要求，因而，现阶段的化学全合成方法很难解决原料药的供应问题。

人们转而试图通过水产养殖的方法富集实验所需的ET－743，并在欧洲进行了对海鞘的大规模养殖实验。通过养殖可以获得大量的海鞘，但其中的ET－743含量变化很大，很难获得稳定的药物来源。最后，负责药物研发授权的Pharma Mar公司在这方面取得了突破，他们以cyanosafracin B(图3)为起始原料，利用该分子与ET－743具有相似的五环骨架和手性中心，进行半合成研究。通过对分子中相应部位的取代基进行结构修饰，最终得到ET－743，总收率1.0%[37]。由于cyanosafracin B 可以通过发酵的方法由荧光假单胞菌大量获得，从而能够获得足够量的药源供应。通过同样的方法，他们还对ET家族其他化合物进行了半合成研究，仍以cyanosafracin B为起始原料，通过对不同官能团的保护、去保护及其他修饰，最终得到不同的目标化合物，包 括 ET－729、ET－745、ET－759B、ET－736、ET－637，及 ET－594[38]。

图3 Cyanosafracin B的分子结构示意图Figure 3 Schematic molecular structure of cyanosafracin B

由于具有了充足的药物来源，ET－743相关的药效学研究、体内代谢研究及药物安全性评价等一系列成药性研究得以顺利开展，并于2001年5月由欧洲药品评估机构批准ET－743作为治疗软组织肉瘤的孤药进入临床研究，2003年10月又批准其作为治疗卵巢癌的孤药，并最终于2007获准上市。

作为第一个海洋抗肿瘤药物，ET－743在其发现近40年、结构确定17年之后得以上市，是海洋药物研究的重要事件，是多领域、多学科科研工作者共同努力的结果。在药物发现的最初10多年时间里，很多科学家参与到活性分子分离纯化和结构鉴定工作中，但均一无所获，是色谱和波谱技术的发展和进步最终导致了ET－743结构的成功鉴定，期间耗费了21年的时间，这也是海洋药物研究由低潮再次走向高潮的一段特定历史时期。

海洋药物研究中另一个不可忽视的问题就是药源问题。与陆生天然产物不同，海洋天然产物往往具有更高的活性和更复杂的结构，其含量也更低，这不但给结构鉴定带来了挑战，同时经常造成活性测试所需药量的严重不足。海洋标本采集的随机性和不确定性，使这一矛盾显得尤为突出。因此，海洋天然产物的药源解决更多地依赖于化学技术及现代生命科学技术，如基因工程、组织培养等。由于海洋分子结构的复杂性，化学合成往往需要经过较长的路线和特殊的反应条件和试剂，这给工业化生产带来了极大障碍。因此，海洋药物的研究尽管方兴未艾，但中间的困难和研究瓶颈值得引起大家的足够关注和重视。

[1]Bergmann W，Burke D C.Contributions to the study of marine products.ⅩⅩⅩⅨ.The nucleosides of sponges.Ⅲ.Spongothymidine and spongouridine[J].J Org Chem，1955，20(11)：1501－1507.

[2]Weinheimer A J，Spraggins R L.The occurrence of two new prostaglandin derivatives (15－epi－PGA2and its acetate，methyl ester)in the gorgonianPlexaurahomomallaChemistry of Coelenterates.ⅩⅤ [J].Tetrahedron Lett，1969，10(59)：5185－5188.

[3]Sigel M M，Wellham L L，Lichter W，etal.In food－drugs from the sea proceedings 1969[C]／／.Youngken H W Jr.，Ed.Washington，DC：Marine Technol Soc，1970：281－294.

[4]Wright A E，Forleo D A，Gunawardana G P，etal.Antitumor tetrahydrodisoquinoline alkaloids from the colonial ascidianEcteinascidiaturbinate[J].J Org Chem，1990，55(15)：4508－4512.

[5]Rinehart K L，Holt T G，Fregeau N L，etal.Ecteinascidins 729，743，745，759A，759B，and 770：potent antitumor agent from the Caribbean tunicate Ecteinascidia turbinate[J].J Org Chem，1990，55(15)：4512－4515.

[6]Sakai R，Rinehart K L，Guan Y，etal.Additional antitumor ecteinascidins from a Caribbean tunicate：crystal structures and activitiesinvivo[J].Proc Natl Acad Sci USA，1992，89(23)：11456－11460.

[7]Sakai R，Jares－Erijman E A，Manzanares I，etal.Ecteinascidins：putative biosynthetic precursors and absolute stereochemistry[J].J Am Chem Soc，1996，118(18)：9017－9023.

[8]Scotto K W.ET－743：more than an innovative mechanism of action[J].Anticancer Drugs，2002，13(Suppl 1)：S3－S6.

[9]Takahashi N，Li W W，Banerjee D，etal.Sequence dependent enhancement of cytotoxicity produced by ecteinascidin 743(ET－743)with doxorubicin or paclitaxel in soft tissue sarcoma cells[J].Clin Cancer Res，2001，7(10)：3251－3257.

[10]Jimeno J M，Faircloth G，Cameron L，etal.Progress in the acquisition of new marine derived anticancer compounds：development of ecteinascidin－743 (ET－743)[J].Drugs Fut，1996，21(11)：1155－1165.

[11]Twelves C，Hoekman K，Bowman A，etal.PhaseⅠand pharmacokinetic study of Yondelis (ecteinascidin－743；ET－743)administered as an infusion over 1hor 3hevery 21days in patients with solid tumours[J].Eur J Cancer，2003，39(13)：1842－1851.

[12]Delaloge S，Yovine A，Taamma A，etal.Ecteinascidin－743：a marine－derived compound in advanced，pretreated sarcoma patients－preliminary evidence of activity[J].J Clin Oncol，2001，19(5)：1248－1255.

[13]Sessa C，De Braud F，Perotti A，etal.Trabectedin for women with ovarian carcinoma after treatment with platinum and taxanes fails[J].J Clin Oncol，2005，23(9)：1867－1874.

[14]Zelek L，Yovine A，Brain E，etal.A phaseⅡ study of Yondelis(trabectedin，ET－743)as a 24hcontinuous intravenous infusion in pretreated advanced breast cancer[J].Br J Cancer，2006，94(11)：1610－1614.

[15]Sch¨offski P，Wolter P，Clement P，etal.Trabectedin (ET－743)：evaluation of its use in advanced soft－tissue sarcoma[J].Future Oncol，2007，3(4)：381－392.

[16]Grosso F，Jones R L，Demetri G D，etal.Efficacy of trabectedin(ecteinascidin－743)in advanced pretreated myxoid liposarcomas：a retrospective study[J].Lancet Oncol，2007，8(7)：595－602.

[17]Roylance R，Seddon B，McTiernan A，etal.Experience of the use of trabectedin(ET－743，Yondelis)in 21patients with pretreated advanced sarcoma from a single centre[J].Clin Oncol(R Coll Radiol)，2007，19(8)：572－576.

[18]Frédéric A，Coosemans A，Renard V，etal.Clinical outcome of ET－743(Trabectedin；Yondelis)in high－grade uterine sarcomas[J].Int J Gynecol Cancer，2009，19(2)：245－248.

[19]Moore B M Ⅱ，Seaman F C，Wheelhouse R T，etal.Mechanism for the catalytic activation of Ecteinascidin 743and its subsequent alkylation of guanine N2[J].J Am Chem Soc，1998，120(10)：2490－2491.

[20]Zewail－Foote M，Hurley L H.Differential rates of reversibility of ecteinascidin 743－DNA covalent adducts from different sequences lead to migration to favored bonding sites[J].J Am Chem Soc，2001，123(27)：6485－6495.

[21]Takebayashi Y，Pourquier P，Zimonjic D B，etal.Anti－proliferative activity of ecteinascidin 743is dependent upon transcription－coupled nucleotide－excision repair[J].Nat Med，2001，7(8)：961－966.

[22]Damia G，Silvestri S，Carrassa L，etal.Unique pattern of ET－743activity in different cellular systems with defined deficiencies in DNA－repair pathways[J].Int J Cancer，2001，92(4)：583－588.

[23]Cvetkovic R S，Figgitt D P，Plosker G L.Ecteinascidin－743(ET－743)[J].Drugs，2002，62(8)：1185－1192 (Erratum：Drugs，2002，62(11)：1634).

[24]Erba E，Bergamaschi D，Bassano L，etal.Ecteinascidin－743(ET－743)，a natural marine compound with a unique mechanism of action[J].Eur J Cancer，2001，37(1)：97－105.

[25]García－Rocha M，Gracía－Gravalos M D，Avila J.Characterisation of antimitotic products from marine organisms that disorganise the microtubule network：ecteinascidin 743，isohomohalichondrin－B and LL－15[J].Br J Cancer，1996，73(8)：875－883.

[26]Zewail－Foote M，Hurley L H.Ecteinascidin 743：a minor groove alkylator that bends DNA toward the major groove[J].J Med Chem，1999，42(14)：2493－2497.

[27]Takebayashi Y，Goldwasser F，Urasaki Y，etal.Ecteinascidin 743induces protein－linked DNA breaks in human colon carcinoma HCT 116cells and is cytotoxic independently of topoisomeraseⅠ expression[J].Clin Cancer Res，2001，7(1)：185－191.

[28]Takebayashi Y，Pourquier P，Yoshida A，etal.Poisoning of human DNA topoisomeraseⅠ by ecteinascidin 743，an anticancer drug that selectively alkylates DNA in the minor groove[J].Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(13)：7196－7201.

[29]Corey E J，Gin D Y，Kania R S.Enantioselective total synthesis of ecteinascidin 743[J].J Am Chem Soc，1996，118(38)：9202－9203.

[30]Endo A，Yanagisawa A，Abe M，etal.Total synthesis of ecteinascidin 743[J].J Am Chem Soc，2002，124(23)：6552－6554.

[31]Chen J，Chen X，Bois－Choussy M，etal.Total synthesis of ecteinascidin 743[J].J Am Chem Soc，2006，128(1)：87－89.

[32]Zheng S，Chan C，Furuuchi T，etal.Stereospecific formal total synthesis of ecteinascidin 743[J].Angew Chem Int Ed Engl，2006，45(11)：1754－1759.

[33]Chandrasekhar S，Reddy N R，Rao Y S.Synthetic studies on ecteinascidin－743：synthesis of building blocks through Sharpless asymmetric dihydroxylation and aza－Michael reactions[J].Tetrahedron，2006，62(51)：12098－12107.

[34]Fishlock D，Williams R M.Synthetic studies on Et－743.Asymmetric stereocontrolled construction of the tetrahydroisoquinoline coreviaradical cyclization on a glyoxalimine[J].Org Lett，2006，8(15)：3299－3301.

[35]Fishlock D，Williams R M.Synthetic studies on Et－743.Assembly of the pentacyclic core and a formal total synthesis[J].J Org Chem，2008，73(24)：9594－9600.

[36]González J F，Salazar L，de la Cuesta E，etal.Synthesis of phthalascidin analogs[J].Tetrahedron，2005，61(31)：7447－7455.

[37]Cuevas C，Pérez M，Martín M J，etal.Synthesis of ecteinascidin ET－743and phthalascidin Pt－650from cyanosafracin B[J].Org Lett，2000，2(16)：2545－2548.

[38]Menchaca R，Martínez V，Rodríguez A，etal.Synthesis of natural ecteinascidins (ET－729，ET－745，ET－759B，ET－736，ET－637，ET－594)from cyanosafracin B[J].J Org Chem，2003，68(23)：8859－8866.