Wistar大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及成骨诱导实验

李贵凤，李　煌，刘　超



论著

Wistar大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及成骨诱导实验

李贵凤，李煌，刘超

目的探讨Wistar大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在体外进行分离、纯化以及定向诱导成骨细胞的方法，为进一步利用BMSCs移植治疗骨组织缺损奠定基础。方法体外分离培养BMSCs，并进行定向的成骨诱导分化，采用茜素红染色、Ⅰ型胶原免疫组织化学染色和免疫组化col-Ⅱ染色等方法进行鉴定。结果经过体外分离培养的大鼠BMSCs在显微镜下为贴壁生长的成纤维样细胞，其形态呈长梭形。经过第一次传代后的BMSCs形态趋于均一，呈漩涡样或者菊花样生长；传代后在7 d内BMSCs生长迅速，在7 d后细胞密度增加，出现接触抑制现象，而使细胞的生长速度减慢。经定向诱导后BMSCs明显表达为成骨表型。结论BMSCs是一种易于在体外分离培养和扩增的细胞群，经体外定向成骨诱导后的BMSCs具有典型的成骨细胞的形态和功能性特征，可以作为骨组织工程的种子细胞。

间充质干细胞；成骨细胞；骨诱导；体外培养；大鼠

[Abstract]Objective To explore the approach to separate and purify Wistar rats'bonemarrow derived mesenchymal stem cells (BMSCs)in vitro and directionally induce osteoblast in order to provide a foundation for further use of BMSCs transplantation to treat bone defect disease.Methods BMSCs from Wistar ratswere isolated and cultured in vitro and directionally induced to osteoblastic differentiation.Identification was made through the methods of alizarin red staining and collagen typeⅠand col-Ⅱimmunohistochemical staining.Results The BMSCs separated and cultured in vitro presented long spindle-shaped fibroblast-like cellswith adherence growth under themicroscope.Themorphology of BMSCs after the first passage tended to be homogeneous with swirl or chrysanthemum like growth.Within 7 days after the passage,BMSCs showed rapid growth.Within 7 days after the passage, the cells grew fast,and the cell density increased after 7 days.Contact inhibition occurred which decreased the cell growth velocity. After the directional induction,BMSCs presented apparent osteogenous phenotype.Conclusion BMSCs can be easily isolated and multiplied in vitro.Those cellswhich were induced to osteoblastic differentiation present typical osteoblastmorphology and functional characteristics.Therefore,BMSCs are the ideal seed cells for the bone tissue engineering research.

[Key words]mesenchymal stem cell;osteoblast;bone induction;culture in vitro;rat

临床上由于各种因素所致的骨及软骨损伤、缺失极为常见。如果发生大面积的骨或骨-软骨的大面积组织缺损，由于它们的自我再生修复能力有限，将会造成器官畸形及功能障碍，从而给患者的生理和心理上造成沉重的负担[1-2]。而在机体的干细胞群中，有一类重要的细胞被称为间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，MSCs来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点，而日益受到人们的关注。在不同的条件下，可以诱导成机体不同的组织，而且MSCs在机体的骨髓及其组织器官中，如骨、软骨、脂肪、内皮、肌肉、神经组织等终生存在，为组织器官修复和更新提供基础[3]。近年来在组织工程骨-软骨的构建中，由于骨髓间充质干细胞（BMSCs）的自我复制和不同条件下诱导的多向分化能力，使其成为组织工程中首选的种子细胞[4]。BMSCs可以从胫骨、股骨、髂骨等部位取材，在这些部位取材方便，并且创伤较小，而且易于在体外分离及扩增纯化。BMSCs在有核细胞中数量较少，约为0.01%，但其有终生分化为骨或软骨细胞的能力。本研究经过分离、扩增大鼠BMSCs，并将其在体外诱导向分化为成骨细胞，检测其成骨活性,为下一步将BMSCs用于骨-软骨组织工程学的研究打下基础[5]。

1　材料与方法

1.1材料和仪器

1.1.1实验材料α-MEM培养基(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，Hepes、ITS、TGF-β1、β-甘油磷酸钠(SIGMA公司)，兔抗鼠conagen-Ⅱ一抗、SABC免疫组化试剂盒（中衫试剂公司），其他试剂均为国产市售分析纯；VS-1300-U型超净工作台，Olympus IX70倒置显微镜，Nikon TE2000-U倒置显微镜，二氧化碳培养箱。

1.1.2实验动物新生3 d龄Wistar大鼠(南京大学医学院实验动物中心提供，动物合格证号2008001652989）24只，体重10 g。

1.2实验方法

1.2.1Wistar大鼠BMSCs的分离与培养取3 d龄Wistar大鼠，断颈脱臼处死，置于75%乙醇溶液消毒15 mins。无菌条件下分离出双侧股骨，剪断股骨干骺端，暴露骨髓腔。以无血清DMEM液冲洗骨髓腔至流出液澄清；收集冲洗液，以1500 r/min离心10min；弃上清，加入DMEM条件培养液(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素及100μg/m l链霉素)混悬。调整细胞浓度为5×106/m l，接种于75ml培养瓶，37℃、5%CO2、饱和湿度培养；2 d后半量换液，以后每2～3 d全量换液1次。待细胞达80%以上融合后，0.25%胰蛋白酶消化，传代培养。

1.2.2Wistar大鼠BMSCs向成骨细胞诱导取传代至第3代的BMSCs，消化、清洗后，以DMEM普通培养液调整细胞浓度为1×106/m l，接种于6孔板内，置37℃、5%C02饱和湿度培养箱中培养。待细胞生长达50%融合时，更换为成骨诱导条件培养液（8～10 mol/L地塞米松、100 mg/ml双抗、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、10 mmol/L Vit C，10%血清）诱导培养，每72 h更换液体，每24 h在倒置显微镜观察细胞的变化以及培养液变化。

1.2.3成骨诱导茜素红染色鉴定成骨诱导2 w后，对细胞爬片进行茜素红染色：将爬满细胞的盖玻片取出，4%多聚甲醛固定20min，在茜素红染液中染色30min，双蒸水冲洗，无水酒精脱色，二甲苯透明，封片，倒置显微镜下观察。

1.2.4Ⅰ型胶原免疫组化染色检测经成骨诱导2 w后，取出6孔板中细胞爬片，PBS液漂洗，4%多聚甲醛固定，PBS漂洗5 min×3次，3%双氧水中10 min，PBS 5 min×3次，封闭30 min，兔抗一抗4℃孵育过夜；PBS 5 min×3次，羊抗兔二抗37℃30min；PBS 5 min×3次，过氧化物酶标记的链球菌亲和素三抗37℃、30 min；PBS 5 min×3次，显色、复染、脱水、封片。

1.2.5Ⅱ型胶原免疫组织化学染色(LSAB法)成软骨诱导2 w后，对细胞爬片进行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：弃去有细胞爬片的6孔板中的培养基，4%多聚甲醛固定，PBS漂洗5 min×3次，3%双氧水中10min，PBS 5 min×3次，封闭30 min，兔抗一抗4℃孵育过夜；PBS 5 min×3次，羊抗兔二抗37℃、30min，PBS 5 min×3次，过氧化物酶标记的链球菌亲和素三抗37℃、30min，PBS 5min×3次，显色、复染、脱水、封片。

2　结果

2.1BMSCs体外培养原代培养接种24 h后，即可见细胞贴壁生长，贴壁细胞多为短梭形或纺锤形；2～3 d可见细胞集落形成，集落中细胞形态为典型的梭形细胞；7～10 d后细胞进入增殖高峰。经过消化、离心、纯化后，贴壁细胞多呈现成纤维细胞样或多角形状态；随细胞生长融合，细胞排列具有方向性，有时呈漩涡状排列。

2.2BMSCs体外诱导成骨观察BMSCs经条件培养液诱导培养2 w后，于倒置显微镜下观察可见细胞呈短梭形或多角形，细胞可集落样生长，集落区可见折光性结节若干，经茜素红染色呈紫红色阳性（图1），Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性(图2)。Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色时即可见阳性表达，聚集形成的结节呈强阳性表达，偶可在小结节看到均匀密布的胞膜胞外基质阳性表达(图3)。

图1　BMSCs诱导14 d，茜素红染色阳性(×100)

图2　BMSCs诱导14 d，Ⅰ型胶原免疫组化染色阳性(SABC×200)

图3　BMSCs诱导14 d，Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性(SABC×200)

3　讨论

BMSCs是一类有多向分化潜能的干细胞，在一定环境和细胞因子的诱导下，可以转化成机体的各种细胞[6-9]。因其来源不受限，取材方便，对供体损伤小，易于分离培养，体外增殖能力强，且免疫原性低，具有多向分化潜能和良好的迁移性，是目前较为理想的骨组织工程种子细胞的来源。在本实验中，我们冲洗Wistar大鼠股骨骨髓腔获得全骨髓细胞，利用不同种类细胞贴壁时间差异筛选BMSCs，并利用消化传代的反复贴壁法，并辅以DMEM基础培养液培养，而进一步纯化BMSCs。待细胞生长融合后，以成骨条件培养液诱导分化，通过细胞形态学观察、组织化学染色及免疫组化等方法检测细胞成骨诱导分化结果。结果发现BMSCs经过诱导2 w后，细胞可呈集落样生长，集落区域可形成茜素红染色阳性的矿化结节，而诱导后细胞经Ⅰ型胶原免疫组化染色后呈阳性表达。这些结果表明，骨髓来源的MSCs经纯化培养后细胞增殖能力良好，而经过成骨诱导培养后，可以向成骨细胞方向分化，且具有一定的分泌和矿化能力。

本实验证实了获取的BMSCs具有多向分化能力，可作为后期实验复合支架体外成骨与成软骨的种子细胞[10-15]。

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Culture of rats'bonemarrow derivedmesenchymal stem cells in vitro and ossification induction experiment

Li Guifeng,Li Huang,Liu Chao Departments of Orthodontics,Affiliated Dental Hospital of Medical College,Nanjing University, Nanjing,Jiangsu,210000,China

RQ813.11/681

A

1004-0188（2016）03-0233-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.03.001

国家自然科学基金课题（81470712）

210000南京，南京大学医学院附属口腔医院正畸科

李煌，E-mail：49095530@qq.com

（2015-12-07）