脑缺血后necroptosis的机制及神经保护

邓锡佳，王鹏旭，佟　彤，林　静，姜春玲

(大连医科大学 1.七年制2010级；2.生理学教研室，辽宁 大连 116044)

脑缺血后necroptosis的机制及神经保护

邓锡佳1，王鹏旭1，佟彤1，林静1，姜春玲2

(大连医科大学 1.七年制2010级；2.生理学教研室，辽宁 大连 116044)

细胞程序性坏死(necroptosis)是一种新型的细胞死亡方式。目前研究的最多的机制为死亡受体(death receptors，DRs)介导的信号转导途径。受体交互作用蛋白(receptor interaction protein ，RIP)1和3是necroptosis信号通路中极为重要的调节蛋白。并且necroptosis能诱导相关的炎症反应，加重组织损伤。新近研究表明脑缺血后脑组织的损伤与necroptosis密切相关。本文就necroptosis的机制及有关神经保护方面的分子靶向研究进展进行综述。

脑缺血；necroptosis；受体交互作用蛋白；炎症反应

[引用本文]邓锡佳，王鹏旭，佟彤，等. 脑缺血后necroptosis的机制及神经保护[J].大连医科大学学报，2015,37(2)：192-195.

脑缺血后公认的细胞死亡类型包括缺血核心区即刻发生的细胞坏死，以及随后再灌注过程中的细胞凋亡，一般认为凋亡是主动的程序性死亡方式，而坏死是被动的无序性过程，不受调控。但近年来的研究发现一种非凋亡性的程序性死亡方式，有坏死的形态学特点，能在干扰半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-8(caspase-8)介导的凋亡时触发[1]，被命名为细胞程序性坏死(necroptosis)，在缺血性脑血管疾病中具有重要的地位。Necroptosis的发现提供了一个对坏死进行调控的机会，因此在研究脑缺血的治疗方案中不仅要抗凋亡，抑制necroptosis也是至关重要的。

1　脑缺血TNFR诱导的necroptosis机制

缺血损伤所致的神经元necroptosis可由DRs发起，目前对necroptosis信号转导通路的认识主要来自肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)的诱导。TNF-α与其受体TNFR结合后，激活的受体可诱导凋亡和necroptosis：当凋亡通路活化时只诱导凋亡；当凋亡通路被抑制时则启动necroptosis通路。TNF与TNFR1结合，导致细胞内募集RIP1、TNF受体相关的死亡结构域(TNF receptor associated death domain，TRADD)、TNF受体相关因子2(TNF receptor associated factor 2，TRAF2)、细胞凋亡抑制蛋白(cellular inhibitor of apoptosis protein，cIAP1/2)、线性泛素链组装复合体(liner ubiquitin chain assembly complex，LUBAC)[2-3]，形成TNF-R1信号复合体，又称复合物Ⅰ。由于E3泛素连接酶活化cIAP1、2和LUBAC，RIP1多泛素化，并作为信号通路的主要枢纽最后激活核转录因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路。NF-κB激活后导致一个强大的促生存信号。而RIP1的泛素化控制着促生存信号与凋亡或necroptosis的转换。去泛素化酶CYLD活化，去除RIP1的泛素和复合物Ⅰ最有可能的其他泛素成分，消除了cIAPs和LUBAC的活性，使复合物Ⅰ失去稳定性[4]。在去泛素化的状态下，RIP1从复合物Ⅰ上释放，与Fas相关的死亡结构域(Fas-associated death domain，FADD)、TRADD和caspase-8形成复合物Ⅱ[5]。复合物Ⅱ的形成导致caspase-8的活化，启动经典的外源性凋亡途径。当caspase-8功能受到抑制，稳定的复合物Ⅱa不再形成[6]。RIP3与RIP1通过共有的同型互动域(RIP homotypic interaction motif，RHIM)结构相互作用，磷酸化，形成有害的复合物Ⅱb(也称necrosome)，驱动necroptosis。而活化的caspase-8通过裂解RIP3，有效地阻断necroptosis[7](图1)。上述资料证实，RIP1和RIP3形成复合物及磷酸化是necroptosis发生的关键，RIP3是坏死与凋亡途径的分路器。

图1　TNFR诱导的necroptosis机制[7]Fig 1 The mechanism of TNFR-induced necroptosis[7]

至于necrosome的下游靶点迄今为止尚不清楚。混合排列激酶域(mixed linage kinase domain like，MLKL)基因敲除小鼠模型的研究表明，在RIP3依赖的necroptosis中MLKL是必不可少的，且介导necrosome形成的下游信号通路[8]。Caspase的活性有赖于一定水平的ATP，而在急性危重病理过程中，细胞能量代谢严重障碍，生成的ATP不足以支持caspase的功能[9]，所以在急性脑缺血的情况下，necroptosis可能是神经元死亡的主要方式。

2　脑缺血中AIF诱导的necroptosis

新形式的necroptosis正不断被公布出来，新近有文献报告烷基化DNA损伤介导了细胞程序性死亡[10]。高水平的DNA烷基化可激活聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase，PARP1)，使细胞凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)从线粒体上释放出来，此过程依赖于半胱氨酸蛋白酶和Bcl-2家族成员BAX。AIF进入胞质后转移至细胞核，与组蛋白H2AX和亲环素A合作，引起DNA降解和细胞程序性死亡。抑制PARP1不能使Jurkat细胞免于necroptosis[1]，但RIP1缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞能抵抗AIF介导的坏死[11]，以上研究表明AIF诱导的necroptosis可能处于RIP1的下游。半胱氨酸蛋白酶的两个家族—calpains和cathepsins，能调节AIF从线粒体的释放，它们的阻断剂能有效地抑制AIF介导的细胞程序性死亡。如calpains和cathepsin B的双重抑制剂E64d，在实验性大鼠局灶性脑缺血中提供了神经保护作用[12]。

3　Necroptosis相关的炎症反应

脑缺血损伤后有大量炎性细胞因子表达和炎性细胞浸润，引起一系列炎症反应，其过度表达可加重脑组织损伤。坏死细胞失去胞膜完整性，细胞内容物释放，诱导炎症反应。这些免疫原性的内源性分子属于损伤关联分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)。体外实验已证实，在胞膜完整性破坏的情况下，necroptotic成分能通过巨胞饮与细胞外液一起被抗原呈递细胞所摄取，启动免疫反应，它有比凋亡细胞的吸收更慢的动力学特征。并且necroptotic细胞持续合成蛋白质直到浆膜透化前的最后一刻[13]，而凋亡细胞潜在的DAMPs被限制在存留的质膜和凋亡小体中。据此可推测，与凋亡相比，necroptotic环境更加富含DAMPs。RIP1除决定细胞的生存和死亡外，在necroptotic细胞中可能也调节细胞因子和危险信号分子的释放。RIP1的激酶活性可介导TNF的产生，导致细胞死亡和炎症反应[14]。尽管RIP1和RIP3在necroptosis中都很重要，但缺乏RIP1时necroptosis也能发生[15]。因此RIP3可能驱动necroptosis的发生；而RIP1可能参与特殊的细胞环境。新近研究阐明，RIP3本身可诱导活性氧的形成，而不是necroptosis，传导免疫反应，激活炎性体[16]。此外，RIP3的表达也取决于细胞类型。RIP3 mRNA在淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞中的表达比在其他细胞类型中更强。因此在正常条件下，可能仅有某些类型的细胞经历necroptosis；但在病理状态下，RIP3表达增强可介导细胞凋亡向necroptosis转化，并加剧炎症反应。

4　针对脑缺血necroptosis的神经保护

Necroptosis可被小分子化合物necrostatin-1(Nec-1)特异性抑制，它的作用靶点为RIP1的激酶部分，阻断RIP1和RIP3的磷酸化[17]。在小鼠局灶性脑缺血模型中使用Nec-1，除能有效地抑制necroptosis之外，还显著地减少了大脑中动脉闭塞后的梗死面积，提高神经功能评分。与凋亡阻断剂zVAD.fmk相比，Nec-1具有一个更长的给药时间窗。更引人注目的是，Nec-1与zVAD.fmk联合使用具有显著的累加效应[1]。在新生儿缺氧缺血模型中，Nec-1不仅保护大脑免受氧化性损伤，而且可显著地阻止其后恶化的免疫细胞浸润[18]。有文献报告7-Cl-O-Nec-1(一种Nec-1的衍生物)在缺血性脑损伤模型中也具有保护作用[19]；能抑制白血病细胞necroptosis，并且比Nec-1的活性更高，而且在高浓度时也没有非特异性的细胞毒性，小鼠静脉注射后显示出良好的药代动力学特征。进一步的研究发现7-Cl-O-Nec-1的代谢稳定性比 Nec-1更高[20]。所以，在细胞内和体内的试验中推荐使用7-Cl-O-Nec-1。另有报告单独使用Nec-1或Gly14-humanin(HNG)(一种凋亡抑制剂)能减少氧和葡萄糖缺乏条件下培养的皮质神经元的死亡，且两者效果相似；Nec-1和HNG联合使用时减少神经元死亡的效果更显著。在小鼠大脑中动脉闭塞的模型中，单独使用Nec-1或HNG均能减少细胞梗死的面积，联合使用时脑梗死面积进一步减少，并提高神经功能评分。上述资料证实，Nec-1和HNG在缺氧和缺血再灌注损伤中具有协同性神经保护作用[21]。凋亡和necroptosis是相互抑制的：如果凋亡被阻断，necroptosis会增强；抑制necroptosis，细胞可能转而发生凋亡。以上研究表明抗凋亡药物和抗necroptosis药物联合使用将会应用在脑缺血的新型治疗中。

敲除小鼠RIP3基因能抑制蛙皮素诱导的胰腺炎和TNF-α介导的休克，而RIP1的抑制剂Nec-1不能产生相同的效应[22]。FADD或caspase-8缺陷的小鼠在胚胎时期就会死亡，但可被RIP3敲除所救治。因此直接以RIP3为靶点的化合物被寄予厚望。目前，有关RIP3的特异性抑制剂仍在研究中，未见报告。最近发现necrosulfonamide(NSA)能在人类细胞中有效地阻断TNF诱导的necroptosis，它的作用靶点为MLKL[23]。敲除RIP3基因或MLKL基因能阻断TNF诱导的necroptosis，然而抑制其中一种蛋白不能阻断细胞死亡，但能使TNF诱导的necroptosis向RIP1依赖的凋亡转化[24]。尽管TNFR诱导的信号通路是目前研究得最多的模型，但necroptosis也能被多个信号转导通路所触发，包括其他死亡受体(如Toll样受体)和细胞内分子(如RHIM域包含蛋白DAI和TRIF)，提示它们可能成为未来的靶向治疗位点。

5　结　语

综上所述，近年来的研究表明，与凋亡一样，某些坏死是一个可被高度调控的过程，这在脑缺血的病理生理和治疗方面有重要的意义。尽管已发现necroptosis的某些控制和执行的分子机制，但关于necroptosis的研究还处于初始阶段。未来研究的焦点在于深入阐明不同的机制，探讨它们在体内的联系，并致力于新型的神经保护药物的研发。

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本刊被国际重要数据库收录情况

截止2011年，本刊已被8种国际重要数据库收录。包括：(1)美国《化学文摘》(CA, Chemical Abstracts)；(2)荷兰《医学文摘》(EM，Excepta Media)，(3)波兰《哥白尼索引》(IC, Index of Copurnicus)；(4)美国《剑桥科学文摘(自然科学版)》(CSA Natural Science)；(5)美国《乌利希期刊指南》(Ulrich PD，Ulrich's Periodicals Directory)；(6)荷兰《文摘与引文数据库》(Scopus)；(7)英国《农业与生物科学研究文摘》(CAB Abstracts，Centre for Agriculture and Bioscience Abstracts)；(8)英国《公共健康》(Global Health，Centre for Agriculture and Bioscience Abstracts)。

Mechanisms and neuroprotection of necroptosis after cerebral ischemia

DENG Xi-jia1,WANG Peng-xu1,TONG Tong1,LIN Jing1,JIANG Chun-ling2

(1.Seven-yearGraduateProgram2010; 2.DepartmentofPhysiology,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China)

Necroptosis is a new type of cell death. Up to now the best investigated mechanism is death receptors-induced signaling pathway. Receptor interaction protein 1 (RIP1) and 3 (RIP3) play crucial roles in the signaling pathway of necroptosis. In addition,necroptosis can induce inflammation and increase tissue damage. Recent studies have shown that brain tissue damage is closely related to necroptosis after cerebral ischemia. In this article,we have reviewed the mechanisms of necroptosis and the molecular targets of neural protection.

cerebral ischemia； necroptosis； RIP； inflammation

综述10.11724/jdmu.2015.02.22

辽宁省优秀中青年骨干教师基金项目(2007)

邓锡佳(1992-)，女，江苏无锡人，七年制学生。E-mail：xijia_deng@163.com

姜春玲，教授。E-mail：chunling_jiang2006@163.com

R743.31

A

1671-7295(2015)02-0192-04

2014-05-09；

2015-03-03)