蛇床子素对大鼠肾脏缺血-再灌注损伤的保护作用

张炯 王佳 陈丽朱 王芳 李贵森

·实验研究·

蛇床子素对大鼠肾脏缺血-再灌注损伤的保护作用

张炯 王佳 陈丽朱 王芳 李贵森

目的建立大鼠肾脏缺血-再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI)模型，研究蛇床子素防治大鼠肾脏IRI的疗效及机制。方法将50只SD大鼠按体质量随机分为假手术组、模型组、蛇床子素(低，中，高)剂量组，每组10只。蛇床子素低、中、高剂量组术前45 min分别给予蛇床子素5、10、20 mg/kg腹腔注射，假手术组和模型组术前45 min给予等体积生理盐水腹腔注射。模型组和蛇床子素(低，中，高)剂量组制备大鼠肾脏IRI模型，假手术组不夹闭左侧肾蒂。用酶联免疫吸附试验检测血肌酐、尿素氮、单核细胞趋化蛋白-1、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6；苏木素伊红染色检测肾组织病理形态；逆转录-聚合酶链反应检测mRNA水平；硫代巴比妥酸比色法检测氧化应激指标。结果与假手术组相比，模型组肾脏病理改变以及血肌酐、尿素氮、单核细胞趋化蛋白-1、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和丙二醛表达水平明显增加，而超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性明显降低。与模型组相比，蛇床子素低、中、高剂量组肾脏病理改变以及血肌酐、尿素氮、单核细胞趋化蛋白-1、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和丙二醛表达水平呈浓度依赖性明显降低，而超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性呈剂量依赖性明显增高。结论蛇床子素对大鼠肾脏IRI有保护作用，其作用机制与抑制炎症和氧化应激相关。

蛇床子素；肾脏缺血-再灌注损伤；氧化应激；炎症

肾脏缺血-再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI)是指高灌注器官肾脏血供中断，重新恢复肾脏血流灌注导致肾脏损伤反而加重的临床危像，好发于冠脉支架植入术后、肾移植、溶栓等临床危重症[1-2]。其发病机制复杂，研究显示炎症和氧化应激是导致肾脏IRI的重要致病机制，因此抑制炎症和氧化应激是减轻肾脏IRI的重要途径[3]。蛇床子素是具有多重生物学活性且无明显毒副作用的香豆素类物质，广泛存在于欧前胡、蛇床等植物，具有抗炎、抗感染、抗肿瘤、抗氧化、清除氧自由基和抗病毒等活性[4-6]。肾脏IRI是由炎症和氧化应激参与调控的复杂病理过程[3]。因此本研究拟通过建立大鼠肾脏IRI模型，研究蛇床子素对肾脏IRI的保护作用及相关机制。

材料与方法

一、材料

1.实验试剂 蛇床子素(Sigma公司,美国)，单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factors α,TNF-α)和白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)，酶联免疫吸附分析试剂盒均购于武汉博士得；TNF-α、IL-6和MCP-1引物擎科生物，丙二醛(malonaldehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)和谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase,GPx)均购自于南京建成生物。

2.实验动物 健康雄性SD大鼠50只，体质量220～250 g(北京华福康公司提供)。动物饲养于四川省人民医院实验动物中心SPF级动物房, 温度为20～25 ℃, 湿度为40%～70%, 光照明暗各12 h, 换气次数为10～20次/h。饲料为SPF级鼠灭菌饲料, 购自四川省医学实验动物中心, 符合GB-15921.2-2014 标准。饮水为经121 ℃ (1.0 kg·cm-2)、30 min 灭菌自来水, 由动物经饮水瓶自由摄取。

二、分组及模型构建

将50只SD大鼠按体质量随机分为假手术组、模型组和蛇床子素低、中、高剂量组,每组10只。蛇床子素低、中、高剂量组术前45 min分别给予蛇床子素5、10、20 mg/kg腹腔注射，假手术组和模型组术前45 min给予等量的生理盐水腹腔注射。模型组和蛇床子素低、中、高剂量组制备大鼠肾脏IRI模型，假手术组操作同上，但不夹闭左侧肾蒂。具体肾脏IRI模型制备方法参考文献[7]：大鼠采用1%戊巴比妥钠(60 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰位固定，用无创血管夹夹闭大鼠左侧肾蒂,夹闭45 min后松开无创血管夹恢复灌注，肾脏由暗红色恢复红润表明再灌注成功，同时去除右肾，然后逐层缝合切口。

三、方法

1.标本收集和检测 恢复大鼠肾脏血液再灌注24 h后, 给予腹腔注射麻醉药品，然后行腹主动脉穿刺取全血以及收取肾脏组织。全血在室温下以3 000 r/min速度离心10 min，取上清液，用酶联合疫吸附试验检测血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、MCP-1、TNF-α和 IL-6的表达水平。将收集的肾脏组织标本三分之一置于多聚甲醛做石蜡切片,其余肾组织冻于-80 ℃冰箱。

2.肾脏病理检查 将多聚甲醛中固定的肾脏标本经脱水、透明、浸蜡、包埋处理、冷却后制成厚度为4 μm的石蜡组织切片，烘干后进行常规苏木素伊红染色(HE)染色。在光学显微镜下观察肾脏组织病理形态学改变，并进行Paller氏评分：每个视野下随机选择10个肾小管计分，肾管明显扩张记1分，细胞扁平或肿胀记2分，刷状缘损伤记1分，脱落记2分，管形记2分，肾小管管腔内有脱落，坏死(未形成管形或细胞碎屑记1分，肾小管正常记0分，量化肾组织损害程度。

3.检测mRNA表达 称取适量肾脏组织，于液氮中研磨成粉末状提取总RNA，反转录为cDNA,以cDNA为模板，进行QPCR为反应，扩增靶基因和内参，目的基因为TNF-α、MCP-1和IL- 6，β-actin为内参，进行逆转录-聚合酶链反应检测。具体扩增条件95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸1 min。共40个循环，得到每个样本的CT(threshold cycle)值法，用得到的各样本的CT值按公式2-ΔΔCT计算相对表达量，每组重复3次。(表1)

表1 本实验所用基因的引物序列

4.氧化应激指标测定 利用硫代巴比妥酸比色法检测肾组织MDA的含量，黄嘌呤氧化酶法检测SOD、CAT和GPx的活性，具体步骤参见相关说明书。

四、统计学处理

应用SPSS 12.0软件进行统计分析，实验结果采用均数±标准差表示，资料采用单因素方差分析，多个样本之间的两两比较采用T检验，Plt;0.05表示差异有统计学意义

结 果

一、蛇床子素对SCr和BUN的影响

与假手术组相比，模型组SCr和BUN均明显增加，差异具有统计学意义(Plt;0.05)。与模型组比较，蛇床子素低、中、高剂量组SCr和BUN均呈浓度依赖性降低，差异具有统计学意义(Plt;0.05)。结果提示蛇床子素可呈浓度依赖性减轻肾脏IRI。(表2)

表2 蛇床子素对SCr和BUN的影响

注：与假手术组比较，aPlt;0.01；与模型组比较，bPlt;0.05

二、蛇床子素可明显减轻肾脏病理改变

假手术组未见明显的肾脏病理形态学改变，模型组肾小管明显扩张，可见细胞核碎裂、坏死、脱落、肾小管明显管腔阻塞、有大量蛋白管型、肾间质有大量炎性细胞浸润。与模型组相比，蛇床子素低、中、高剂量组肾小管扩张，异常形态细胞、细胞坏死、肾间质炎性细胞浸润均呈浓度依赖性明显减少。结果提示蛇床子素可呈浓度依赖性减少肾脏病理形态改

变。(图1)

三、蛇床子素对TNF-α、MCP-1和IL-6 mRNA表达影响

与假手术组比较，模型组肾脏TNF-α、MCP-1和 IL-6的mRNA表达水平明显增加，差异有统计学差异(Plt;0.05)；与模型组相比，蛇床子素低、中、高剂量组肾脏TNF-α、MCP-1和 IL-6 mRNA表达水平呈浓度依赖性明显减少，差异有统计学差异(Plt;0.05)。结果提示蛇床子素可减轻肾脏促炎症细胞因子TNF-α、MCP-1和IL- 6的mRNA表达水平。(表3)

四、蛇床子素对TNF-α、MCP-1和IL- 6分泌影响

与假手术组比较，模型组血清中TNF-α、MCP-1和 IL-6表达水平明显增加，差异有统计学差异(Plt;0.05)；与模型组相比，蛇床子素低、中、高剂量组血清中TNF-α、MCP-1和 IL-6表达水平呈浓度依赖性明显减少，差异有统计学差异(Plt;0.05)。结果提示蛇床子素可减少促炎症细胞因子TNF-α、MCP-1和IL-6的分泌。(表4)

五、蛇床子素对肾脏促氧化应激酶的影响

假手术组MDA含量为(3.05±0.25) nmol/mg, 模型组MDA含量为(13.18±3.92) nmol/mg, 较假手术组明显增高，差异具有统计学差异(Plt;0.05)。蛇床子素低、中、高剂量组MDA含量分别为(9.02±2.18)nmol/mg、(6.78±1.74)nmol/mg、(4.12±1.02)nmol/mg,与模型组相比，肾组织MDA的含量呈浓度依赖性明显降低，差异具有统计学差异(Plt;0.05)。这提示蛇床子素可呈浓度依赖性减少MDA的表达。

六、蛇床子素对肾脏抗氧化应激酶活性的影响

黄嘌呤氧化酶法检测结果显示：模型组与假手术组相比，CAT、GPx和SOD活性明显降低，差异具有统计学差异(Plt;0.05)。蛇床子素低、中、高剂量组与模型组相比，CAT、GPx和SOD的活性呈浓度依赖性明显增加，差异具有统计学差异(Plt;0.05)。这提示蛇床子素可增加肾脏抗氧化应激酶CAT、GPx和SOD活性。(表5)

注：与假手术组比较，aPlt;0．01；与模型组比较，bPlt;0．05图1 蛇床子素对肾脏病理形态的影响

表3 蛇床子素对肾脏促炎症细胞因子mRNA表达水平的影响

注：与假手术组比较，aPlt;0.01；与模型组比较，bPlt;0.05

表4 蛇床子素对血清中促炎症细胞因子

注：与假手术组比较，aPlt;0.01；与模型组比较，bPlt;0.05

讨 论

IRI是一个复杂的病理生理过程，自60年代心脏IRI提出以来，在临床相继发现在器官移植、心肺复苏和休克治疗等均可发生IRI[8-9]。作为血流高灌注器官之一的肾脏，肾脏IRI容易引发肾脏叶间动脉受损，导致肾脏微血管损伤，引发肾小管代谢紊乱乃至坏死，进而影响肾脏血流，引起肾脏细胞凋亡、坏死、乃至肾功衰竭，是目前引起急性肾衰最常见的原因之一。但目前治疗措施有限，因此寻找新的干预治疗措施减轻肾脏IRI具有重要的临床现实意义[10-11]。目前在大鼠诱导肾脏IRI模型常规有两种方式，一种是夹闭大鼠双侧肾蒂，另外一种是夹闭大鼠单侧肾蒂。因夹闭大鼠单侧肾蒂更能模拟临床，因此本实验通过夹闭大鼠左侧肾蒂，并去除右肾的方法诱导肾脏IRI[8-10]。在本研究中，肾脏IRI可导致肾小管明显扩张，细胞核碎裂、坏死、脱落、肾小管明显管腔阻塞、大量蛋白管型、肾间质大量炎性细胞浸润以及SCr和BUN明显升高，提示肾脏IRI可导致肾脏病理结构改变和肾功受损，这与既往研究相一致。而蛇床子预处理可呈浓度依赖性减少肾脏病理结构的改变和血清SCr和BUN的下降，提示蛇床子素对肾脏IRI具有保护作用，而且在5～20 mg/kg范围内，呈浓度依赖性。但具体机制不明。

既往研究显示肾脏IRI的发病机制涉及炎症反应、氧化应激、中性粒细胞聚集、钙超载、凋亡等[12-13]。氧化应激与肾脏IRI密切相关，肾缺血可使氧自由基生成增多，并可通过膜脂质过氧化加剧肾脏损伤。MDA 是氧自由基引发的脂质过氧化反应的终末产物，具有很强的细胞毒作用，MDA的表达水平可反映机体受自由基损伤程度[14]。CAT、GPx和SOD是体内活性较强的氧自由基清除酶类，其表达量的高低可间接反映机体受氧自由基损伤程度[15]。研究结果显示，肾脏IRI可增加MDA的表达量，减少CAT、GPx和SOD的活性，而蛇床子素可呈浓度依赖性减少MDA的含量，提高CAT、GPx和SOD活性，提示蛇床子素可通过提高机体的抗氧化应激能力而减轻对肾脏IRI，这可能与蛇床子素具有抗氧化应激能力相关。有研究提示，炎症可加剧肾脏IRI的进程并影响肾功的恢复及预后[3]。肾脏IRI可导致促炎炎症细胞因子生成增加，从而进一步加重肾脏损伤。TNF-α、MCP-1和IL- 6是熟知的致炎细胞因子，可加剧炎症反应、促进肾小管上皮细胞的凋亡、坏死以及肾功的受损[2-3]。本研究结果显示，蛇床子素可呈浓度依赖性减少TNF-α、MCP-1和IL- 6的表达，表明蛇床子素对肾脏IRI的保护作用可能与其抗炎作用相关。

表5 蛇床子素对肾脏氧化应激酶活性的影响

注：与假手术组比较，aPlt;0.01；与模型组比较，bPlt;0.05

综上所述，蛇床子素对肾脏IRI具有保护作用，该作用机制可能与蛇床子素具有抑制炎症和提高机体抗氧化应激能力相关。

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ProtectiveeffectsofOstholeonrenalischemiareperfusioninjury

ZHANGJiong,WANGJia,CHENLi-zhu,WANGFang,LIGui-sen.

DepartmentofNephrology,SichuanProvincialPeople'sHospital,Chengdu610072,China

LIGui-sen,E-mail:guisenli@163.com

ObjectiveTo establish a model of renal ischemia-reperfusion injury (IRI) in rats and study the effect and mechanism of osthole on renal IRI in rats.MethodsA rat model of renal IRI was constructed by clamping the left renal pedicle of the rats for 45 min, removing the right kidney, and restoring the renal blood flow for 24 h. Fifty SD rats were randomly divided into sham operated group, renal IRI group, and osthole (low, middle, high) dose groups. 45 min before operation, osthole (5, 10, and 20 mg/kg) was given by intraperitoneal injection in osthole groups. In the sham operated group and renal IRI group, the same volume of normal saline was intraperitoneally injected 45 min before operation. RT-PCR was used to detect the mRNA expression levels of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6). ELISA was used to detect serum creatinine (SCr), blood urea nitrogen (BUN), MCP-1, TNF-α and IL-6. Hematoxylin eosin staining (HE) was used to examine the pathological morphology of renal tissues. The thiobarbituric acid colorimetric method was used to measure malondialdehyde (MDA) content in renal tissues. The xanthine oxidase method was used to determine the activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx).ResultsAs compared with sham operated group, renal pathological changes were aggravated, SCr, BUN, MCP-1, TNF-α, IL-6 and MDA levels were significantly increased, and SOD, CAT and GPx activity decreased significantly in IRI group. As compared with IRI group, the pathological changes of renal tissues were significantly alleviated, SCr, BUN, MCP-1, TNF-α, IL-6 and MDA were significantly decreased in a concentration-dependent manner, and SOD, CAT and GPx activity increased in a dose-dependent manner in osthole-treated groups.ConclusionsOsthole has protective effects on renal IRI in rats, which may be related to the inhibition of inflammation and oxidative stress.

Osthole; Ischemia-reperfusion injury; Inflammtion; Oxidative stress

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.11.011

国家自然科学基金(No.81401362, 81100575)；四川省科技支撑计划(No.2015SZ0245)；四川省青年科技创新研究团队发展项目(No.2015TD0013)

610072 成都，四川省人民医院肾内科(张炯，王芳，李贵森)，全科(王佳，陈丽朱)

李贵森，E-mail:guisenli@163.com

2016-07-23

2017-08-15)