冬凌草甲素通过调节氧化应激和脂代谢减轻糖尿病大鼠肾损伤

吴岚 包丽萍 李菊霜 吴小燕

·实验研究·

冬凌草甲素通过调节氧化应激和脂代谢减轻糖尿病大鼠肾损伤

吴岚 包丽萍 李菊霜 吴小燕

目的研究冬凌草甲素对糖尿病大鼠肾脏的保护作用。方法将24只SD大鼠随机分正常对照组(NC)、糖尿病组(DM)、冬凌草甲素组(DO)，DM组和DO组大鼠用腹腔注射链脲佐菌素制备糖尿病模型。DO组大鼠给以冬凌草甲素10 mg/kg灌胃，NC组和DM组大鼠均给予等量的生理盐水灌胃。3组大鼠干预给药8周后，检测24 h尿蛋白、血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、三酰甘油(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein cholesterol，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol，LDL)；PAS染色观察肾组织病理学改变；试剂盒检测肾组织匀浆中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)活性及丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)含量；用免疫印迹试验和逆转录聚合酶链反应检测SOD蛋白和mRNA表达情况。结果糖尿病大鼠24 h尿蛋白、SCr、BUN、TC、TG、LDL水平升高(Plt;0.05)，HDL降低，肾组织病理肾小球肥大，肾组织SOD和GSH-Px活力下降(Plt;0.05)，SOD蛋白和mRNA表达下降，MDA含量升高(Plt;0.05)。冬凌草甲素处理后可部分逆转肾功能，减轻肾组织损伤；提高SOD、GSH-Px活力，并增加SOD蛋白和mRNA表达，降低MDA含量,即调节氧化应激；冬凌草甲素处理降低TC、TG、LDL水平，HDL升高，即改善脂代谢(Plt;0.05)。结论冬凌草甲素能通过抑制氧化应激和改善脂代谢减轻糖尿病大鼠肾损伤。

冬凌草甲素；氧化；脂代谢；糖尿病肾病

糖尿病肾病(diabetic nephropathr,DN)是糖尿病常见的慢性并发症之一，是导致终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)的主要原因[1]。DN的发病机制复杂，迄今尚未完全清楚。氧化应激通过多种途径引起肾小球内高压、高灌注、高滤过，损伤肾组织[2]。抗氧化治疗一直被认为是DN治疗有效策略。DN常伴有脂代谢紊乱，高血糖及血糖波动异常均可导致机体脂质过度堆积、去脂质作用减弱。脂代谢紊乱也会促进DN的发生发展，但目前相关研究尚不多见[3-4]。冬凌草甲素是传统中药冬凌草的主要药理作用成分，现代药理研究发现冬凌草甲素具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤、增强机体免疫力等功效[5-9]。本研究观察冬凌草甲素对糖尿病大鼠氧化应激和脂代谢的影响，为DN的治疗提供新的选择。

材料与方法

一、材料

1.实验试剂 冬凌草甲素(纯度≥98%)购自西安昊轩生物科技有限公司；链脲佐菌素(streptozocin，STZ)购自美国Sigma公司；尿蛋白、血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、三酰甘油(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein cholesterol，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol，LDL)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)及丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；SOD、3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPD)抗体购自美国Abcam公司；Trizol试剂、PCR所用引物由美国Invitrogen公司合成。

2. 实验动物 SPF级8周龄雄性SD大鼠24只(湖北省疾病预防控制中心提供)，体质量180～200 g，中南医院动物房饲养，温度18 ℃～22 ℃，湿度50%～60% ，明暗各12 h交替一次。

二、动物分组与模型制备

将24只健康雄性SD大鼠采用随机数字表法分为正常对照组(简称NC组)、糖尿病组(简称DM组)和冬凌草甲素组(简称DO组)，每组各8只。DM组及DO组大鼠高脂饲料喂养21 d后，禁食16 h，然后按35 mg/kg单次腹腔注射链脲佐菌素(使用时溶于pH 4.0的0.1 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中)；72 h后，大鼠尾静脉采血测定血糖值，以血糖gt;16.7 mmoL/L作为糖尿病大鼠成模标准。NC组以普通饲料喂养，单次腹腔注射0.1 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，注射量为6 ml/kg。

三、干预方法

从糖尿病大鼠成模第2天开始，DO组大鼠每日9∶00～10∶00给以冬凌草甲素10 mg/kg灌胃，NC组和DM组大鼠均给予等量的生理盐水灌胃。所有大鼠均自由采食，饮水。

四、标本采集

3组大鼠干预给药8周后，将大鼠置于代谢笼中，收集24 h尿液，测24h尿蛋白；随后腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，心脏采血测SCr、BUN、TC、TG、HDL、LDL；然后处死大鼠，取肾脏组织，放置于-80 ℃冰箱中，检测SOD活性、GSH-Px活性、MDA含量以及SOD蛋白和mRNA表达。部分大鼠肾脏固定于4%多聚甲醛，包埋后切片行PAS染色。

五、血糖测定及试剂盒检测

采用拜安捷血糖仪测定血糖，考马斯亮蓝法测定24 h尿蛋白，苦味酸法检测肌酐，脲酶法检测尿素氮，比色法测定肾组织SOD、MDA，羟胺法测定肾组织GSH-Px。尿蛋白、SCr、BUN、SOD、GSH-Px、MDA检测均按试剂盒说明书操作。

六、肾脏病理观察

大鼠肾脏经多聚甲醛固定，石蜡包埋，组织切片，厚度3 μm，行PAS染色。每张片子分别取20个完整的肾小球，拍照，运用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测定肾小球面积。

七、免疫印迹试验检测SOD蛋白表达

提取肾组织蛋白，BCA法测蛋白浓度，变性后取20 μg蛋白SDS-PAGE凝胶电泳，湿法转入PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h后加SOD(1∶1000)和GAPDH(1∶1 000)一抗，4 ℃过夜。TBST洗膜3次后，加入二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化学发光法曝光。以GAPDH(1：1000)为内参照，通过计算目标蛋白与GAPDH蛋白的灰度比值进行半定量分析。

八、检测肾组织中SOD mRNA

取出液氮中的肾组织样本，取50 mg采用Trizol一步法提取总RNA，紫外分光光度计测定纯度并定量。PCR反应体系中SOD正义链：5’-CCGAGGAGAAGTACCACGAG-3’，反义链：5’-GCTTGATAGCCTCCAGCAAC-3’;GAPDH正义链：5’-AACGACCCCTTCATTGAC-3’,反义链：5’-TCCACGACATACTCAGCAC-3’。按反转录试剂盒操作合成cDNA，以cDNA为模板，以GAPDH为内参，SYBR Green为荧光标记物实时定量PCR检测SOD的相对表达量。按下列反应条件进行扩增：94 ℃ 5 min，1个循环；94 ℃ 30 s， 56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min后 结束扩增反应．取5 μl PCR产物与2 μl上样缓冲液混合，进行2%琼脂糖凝胶电泳，100 V 1.5 h，电泳结束后凝胶成像仪分析。每个样品的逆转录-聚合酶链反应重复3次。

九、统计学处理

采用Graphpad 5.0统计软件进行分析处理，结果以均数±标准差表示，2组间统计学分析用t检验，Plt;0．05表示差异有统计学意义。

结 果

一、生化指标的变化

与NC组相比，DM组和DO组给予链脲佐菌素后血糖明显升高(Plt;0.05)，而DM组和DO组间无差别(Pgt;0.05)；与NC组相比，DM组24 h尿蛋白、SCr、BUN升高(Plt;0.05)；与DM组比较，DO组24 h尿白蛋白、SCr、BUN下降。(表1)

表1 各组一般生化指标的比较

注：与NC组比较，aPlt;0.05；与DM组比较，bPlt;0.05

二、脂代谢的变化

与NC组相比，DM组TG、TC、LDL明显升高(Plt;0.05)，HDL降低(Plt;0.05)；与DM组比较，DO组TG、TC、LDL降低(Plt;0.05)，HDL升高(Plt;0.05)。(表2)

表2 各组脂代谢指标的比较

注：与NC组比较，aPlt;0.05；与DM组比较，bPlt;0.05

三、糖尿病肾脏组织学的改变

与NC组相比，DM组大鼠肾小球面积增大，冬凌草甲素处理后，减轻糖尿病大鼠的肾小球肥大。(图1)

注：与NC组比较，aPlt;0．01；与DM组比较，bPlt;0．01图1 各组大鼠肾脏组织病理(PAS染色，×200)及肾小球面积

四、抗氧化物酶活性及脂质过氧化产物的变化

与NC组比较，DM组SOD和GSH-Px活性明显下降(Plt;0.05)，而脂质过氧化产物MDA含量明显增加(Plt;0.05)。与DM组比较，冬凌草甲素处理提高抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性，降低MDA含量，差异有统计学意义(Plt;0.05)。(图2)

五、SOD蛋白及mRNA表达的变化

与NC组比较，DM组SOD蛋白及mRNA表达明显下降，冬凌草甲素处理提高了SOD蛋白及mRNA表达，差异有统计学意义(Plt;0.05)。(图3)

讨 论

近20年来，糖尿病发病率突飞猛进，成为21世纪威胁人类健康的最重要的慢性非传染病之一。DN为糖尿病常见并发症，是造成ESRD或患者死亡的主要原因之一。国际糖尿病联盟预测到2025年其患病总人数将会增长到3.8亿[10],DN防治形势严峻。

注：与NC组比较，aPlt;0．01；与DM组比较，bPlt;0．05图2 各组大鼠肾脏组织抗氧化物酶活性及脂质过氧化产物

注：与NC组比较，aPlt;0．01；与DM组比较，bPlt;0．01图3 各组大鼠肾脏组织SOD蛋白及mRNA表达

高糖条件下，机体清除氧自由基的酶的活性降低，同时体内氧化应激作用增强，造成体内大量活性氧自由基的积聚，因此氧化应激在DN发病机制中发挥重要作用。针对氧化应激的治疗可有效保护肾功能，延缓DN的进展。动物实验和临床试验已经证明使用经典抗氧化剂维生素E和维生素C抗氧化治疗可有效保护肾功能[11-12]。近年来，传统医学尤其是中医药结合现代生物医学技术方法在DN的研究和治疗上具有非常独特之处，研究表明中药在控制血糖、尿白蛋白、SCr、BUN等方面具有明确的的疗效[13]。冬凌草甲素是传统中药冬凌草的主要药理作用成分，近来研究表明，冬凌草甲素具有较强的抗氧化活性，可以下调细胞内氧自由基水平的作用[14]。然而在肝星状细胞中，冬凌草甲素增强ROS水平，降低GSH水平[15]。在本研究中，糖尿病大鼠表现出24 h尿蛋白升高，肾功能下降，肾组织病理肾小球肥大，肾组织脂质过氧化产物MAD水平升高，而抗氧化物酶SOD和GSH-Px活性下降，SOD蛋白和mRNA的表达水平下降。冬凌草甲素处理后，有效降低24h尿蛋白和MDA水平，改善肾功能和肾组织病理改变，提高抗氧化物酶SOD和GSH-Px活性，并增加SOD蛋白和mRNA的表达水平。本研究证明了冬凌草甲素对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肾脏具有保护作用，其作用的发挥与冬凌草甲素的抗氧化应激作用有关。在角质细胞中的研究表明冬凌草甲素可通过改变miRNA表达来介导对氧化应激的调节[16]。核因子NF-E2相关因子(mulear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)对维持细胞内氧化还原平衡发挥重要作用，Nrf2激活后由细胞质转移到细胞核，编码抗氧化物酶，包括醌还原酶、血红素氧化酶(HO-1)等[17]。近来研究也表明，冬凌草甲素可激活Nrf2信号通路[17]，显著提高细胞内醌还原酶的mRNA和蛋白表达水平[18]，这提示冬凌草甲素可能通过激活Nrf2信号通路，增加抗氧化物酶，发挥抗氧化应激的作用。内质网应激是细胞抵抗应激的自我保护重要。研究表明冬凌草甲素可活化RNA激活蛋白激酶样内质网激酶、活化转录因子6和抑制物阻抗性酯酶1，增加CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白表达，诱导细胞内质网应激[22]。然而目前冬凌草甲素对DN氧化应激的作用进一步的机制仍有待阐述。

高血糖能够诱导脂质过氧化,降低脂蛋白脂肪酶，导致机体去脂质作用减弱,脂质过度堆积，TC、LDL等含量增加，同时脂代谢紊乱也能促进糖尿病肾病进展[3, 23]。研究表明升高的TG和降低的HDL是DN的重要危险因素[24]，可引发和加速肾小球硬化的进展，但发病机制不明。流行病学数据也表明：高脂血症往往预示着DN的不良预后。随着治疗理念的不断进步，在DN的预防与治疗中，对血脂的干预已经提升至血糖、血压同等地位。在本研究中，冬凌草甲素无降低血糖的作用，糖尿病组大鼠TG、TC、LDL水平升高，HDL水平下降，冬凌草甲素处理后降低TG、TC、LDL水平，升高HDL水平。冬凌草甲素可改善糖尿病的脂代谢紊乱，且调节脂代谢的作用与血糖无关。脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)是脂肪酸合成的限速酶,主要存在于肝脏、脂肪等组织中,其活性与体内脂肪合成的能力相关。因此，FAS对机体的脂质代谢调节起着重要的作用。冬凌草甲素调节脂代谢有研究表明冬凌草甲素是的FAS抑制剂，冬凌草甲素可有效抑制人结肠直肠癌细胞中的FAS的mRNA和蛋白表达，降低细胞棕榈酸酯和硬脂酸的水平[25]。这提示冬凌草甲素发挥调节脂代谢的作用可能与抑制FAS相关。

总之，冬凌草甲素可通过调节氧化应激和脂代谢减轻糖尿病大鼠肾损伤，冬凌草甲素是潜在的DN的辅助用药，可能在以后的临床实践中推广应用。

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Oridoninrelievesrenaldamageofdiabeticratsthroughmodulationofoxidativestressandlipidmetabolism

WULan,BAOLi-ping,LIJu-shuang,WUXiao-yan.

DepartmentofNephrology,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430071,China

WUXiao-yan,E-mail:wuxiaoyan2k6@163.com

ObjectiveTo investigate the protective effect and mechanism of oridonin on kidney of diabetic rats.MethodsSD rats were randomly divided into three groups (n=8 per group) as follows: normal group (NC), diabetic mellitus group (DM), diabetic mellitus treated with oridonin group (DO). The rat diabetic model was established by intraperitoneal injection of STZ once. Oridonin was administered by gavage to the rats of DO group at a dose of 10 mg/kg/day for 8 weeks. The rats in NC group and DM group were treated with equal volume of normal saline. The animals were sacrificed after 8 weeks of treatment with oridonin. The 24-h urinary protein, serum creatinine (SCr), blood urea nitrogen (BUN), triglyceride (TG), total cholesterol (TC), high-density lipoprotein (HDL), low-density lipoprotein (LDL), and the activity of superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) and the content of malondialdehyde (MDA) in renal tissues were determined. Western blotting and RT-PCR were used to detect the protein and mRNA expression of SOD. PAS staining was used to observe the pathological changes of renal tissues.ResultsAs compared with NC group, DM group had significantly increased proteinuria, SCr, BUN, TG, TC and LDL, and decreased HDL. The content of MDA was increased but the activity of SOD and GSH-Px were decreased in renal tissues in DM group (Plt;0.05). The protein and mRNA expression of SOD was decreased in renal tissues in DM group (Plt;0.05). Oridonin treatment could reverse the renal function and renal histopathological changes, decrease the content of MDA, and increase the activity of SOD and GSH-Px (Plt;0.05). The protein and mRNA expression of SOD was also up-regulated in renal tissues of rats treated with oridonin. And the levels of TG, TC and LDL were decreased, and the level of HDL was increased in plasma under the treatment of oridonin (Plt;0.05).ConclusionsOridonin relieves renal damage of diabetic rats through modulation of oxidative stress and lipid metabolism.

Oridonin; Oxidative stress; Lipid metabolism; Diabetic nephropathy

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.11.012

国家自然科学基金(No.81170679)

430071 武汉，武汉大学中南医院肾内科

吴小燕，E-mail：wuxiaoyan2k6@163.com

2017-09-11

2017-10-28)