miRNA-1236通过靶向FOXO3a调控结直肠癌细胞增殖的作用及机制研究

孙宇 朱琳 刘祯璐 杨明 余贞 孙静 王妍 蒋雨含 李红岩 孙辉,4

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）在中国癌症发病率中排名第二，世界癌症发病率排名第三，是导致癌症相关死亡的主要原因之一［1］。在亚洲，尤其是在发展中国家，CRC的发病率在1998年至2007年间迅速上升，已经严重威胁人类健康［2］。

叉头转录因子O亚家族3a（FOXO3a）是FOXO家族的抑癌基因，可以调控多种参与细胞增殖、细胞周期和凋亡的基因，如BIM（细胞死亡的Bcl-2相互作用介质），PUMA（p53上调凋亡调控因子），CKI（细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂），p27Kip1，cyclin D1（细胞周期蛋白依赖性激酶D1）。它控制着肿瘤细胞的各种信号通路和多种生物学过程［3］。FOXO3a表达降低与乳腺癌、胰腺癌、肝癌、膀胱癌等多种肿瘤的发生、进展和耐药有关［4-7］。同时有研究报道在CRC中FOXO3a表达异常降低，提示其可能具有抑癌作用［8-9］。

MicroRNAs（miRNAs）是一种非编码小RNA分子，通过部分序列同源性结合到哺乳动物mRNA的30个未翻译区域（3′UTR），并引起蛋白质翻译抑制或mRNA降解，或两者都发生，从而在转录后水平调控基因表达［10］。同时有研究表明miR-1236，可通过ceRNA作用方式参与LncRNA FAL1促进肝癌细胞增殖［11］。其在结直肠癌中有无作用尚无明确报道，本实验旨在证明FOXO3a为miR-1236的靶基因，为进一步阐明miR-1236在肿瘤信号通路中发挥的调控作用奠定基础。

材料和方法

一、材料

收集2018年1月至2018年6月哈尔滨医科大学附属第二医院10例经病理学确诊为结直肠腺癌患者的癌组织和癌旁组织，所有实验都遵照哈尔滨医科大学伦理委员会的相关规定进行收集。

二、实验方法

本研究通过http://ualcan.path.uab.edu/网站获取了TCGA数据库中FOXO3a在结直肠癌患者中各种样本的表达。本研究检测了FOXO3a基因在癌-癌旁，不同肿瘤阶段与不同性别中的表达。

（一）细胞培养及转染

人结直肠癌HCT116细胞在5%CO2、37 ℃孵箱中培养，加入10%的胎牛血清，100 ug/mL的抗生素（青霉素，链霉素）。依据不同处理方法，分为5组：（1）对照组（空白对照）；（2）阴性对照组1（转染不含miR-1236 mimics的脂质体）；（3）miR-1236 mimics组（转染含miR-1236 mimics的脂质体）；（4）阴性对照组2（转染不含miR-1236 inhibitor的脂质体）；（5）miR-1236 inhibitor组（转染含miR-1236 inhibitor的脂质体），通过Lipofectamine®3000转染到HCT116细胞中，经过48 h后收集各组细胞进行相关实验。

（二）免疫组织化学实验

取结直肠癌组织做成组织切片，一抗于4 ℃用微量离心机以1 500转离心2 min，室温孵育1 h，完成后用PBS清洗3次，每次5 min。二抗于4 ℃用微量离心机以1 500 转离心2 min，室温孵育1 h，完成后PBS清洗3次，每次5 min。将盖玻片放于纸巾上，滴加1滴Gelvatol于盖玻片中央。翻转载玻片放于盖玻片上，勿施压。将玻片置工作台上，用铝箔覆盖避光放置30 min，使Gelvatol凝结。显微镜观察结果。

（三）蛋白免疫印迹法

将含蛋白酶抑制剂（罗氏，瑞士）和RIPA裂解液加入细胞培养皿中，裂解细胞，超声破碎3次后，13 500转/min（4 ℃）离心12 min并收集上清液。利用BCA法进行蛋白定量。通过12.5% SDS-PAGE分离等量的蛋白质并转移到醋酸纤维素膜上（Pall公司，美国）。室温封闭后1 h后，分别与一抗β-actin（1:1 000，Cell Signaling Technology，USA），PCNA（1:1 000，Cell Signaling Technology，USA），Bax（1:1 000，Cell Signaling Technology，USA）和 FOXO3a（1:500，万类生物，中国）于4 ℃冰箱中孵育过夜。PBST洗涤3次，每次15 min后，分别用抗兔或抗鼠二抗（1:10 000）室温孵育1 h。通过理光公司的红绿荧光显色进行发光。

（四）CCK-8细胞活性检测

本研究选用CCK-8细胞活性试剂盒（碧云天，上海，中国）来检测转染miR-1236后HCT116细胞的活性。首先，将约5×104个细胞接种于96孔板中。当达到所需汇合程度后，将细胞放在37 ℃的5% CO2培养箱中分别转染miR-1236 mimic和miR-1236 inhibitor及其相应的阴性对照48 h后，按照CCK-8操作流程进行实验，并在酶标仪中测量490 nm处的吸光度，使用以下公式计算细胞活力百分比：

细胞活力的百分比=（实验样本的吸光度/对照的吸光度）×100%。

（五）克隆形成

将8×102个HCT116细胞培养于6 cm培养皿中14天后。弃去培养基，并用PBS漂洗。用20%甲醇固定，用0.1%结晶紫染色，弃去上膜表面细胞。统计超过100个细胞组成的菌落为计数单位。在显微镜下随机选取五个区域的细胞进行拍照和计数。

（六）Ki-67 免疫荧光

HCT116细胞接种于含有无菌盖玻片的6孔板中，分别转染miR-1236 inhibitor以及其miR-inhibitor NC 48 h后。将Ki-67（Cell Signaling Technology，美国）抗体孵育1 h后，加入荧光显色剂Alexa-488在室温孵育20 min。然后，用DIPA染细胞核。通过免疫荧光显微镜进行拍摄。

（七）RNA提取和实时定量PCR

采用Trizol试剂提取总RNA（Invitrogen公司，美国）。利用superscriptase II（Invitrogen公司，美国）逆转录试剂盒逆转录成cDNA。实时定量PCR法检测miR-1236表达水平。实时定量PCR采用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒（Life Technologies， 美 国），PCR仪 为ABI 7500实时定量PCR仪（ABI，美国），PCR扩增条件为：95 °C 变性 30 s，60 °C 退火 30 s，72 °C延伸35 s，共30个循环。以下引物用于实时荧光 定 量 PCR 检 测：miR-1236-F：5′-UCUGGCU CCGUGUCUUCAC UCCC-3′；miR-1236-R：5′-UUCUCCGAACGUG UCACGU-3′；GAPDH-F：5′-CCTGCACCACCAACTGCTTA-3′；GAPDH-R：5′-GGCCATCCACAGTCTTCTGG-3′。

（八）Luciferase基因分析报告

将5×103个HCT116细胞接种于96孔板，24 h后，通过lipofectamine 2 000共转染pmirglo-FOXO3-wt或 pmirglo-FOXO3-mut＋ miR-1236或miR-mimic NC。48 h后收集相应的细胞，按照luciferase报告实验流程进行检测荧光素酶活性。

三、统计学分析

采用SPSS19.0进行统计分析，GraphPad Prism 5.0软件处理。实验数据均以3～6次实验结果的平均数±标准误（mean±SD）表示。所有数据采用配对t检验的方法进行统计，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、miR-1236对于结直肠癌细胞HCT116活性的影响

为了研究miR-1236在结直肠癌中的作用，本研究首先通过qRT-PCR方法检测转染miR-1236 mimic以及inhibitor后miR-1236的表达，本研究发现miR-1236 inhibitor组相对于阴性对照明显降低，而miR-1236 mimic组相对于阴性对照，其表达明显升高（图1A）。随后，本研究通过CCK-8方法检测miR-1236对于HCT116细胞活性的变化，低表达miR-1236后能够明显降低HCT116的活性，而高表达miR-1236能够促进HCT116细胞的活性增加（图1B）。同时通过克隆形成实验进一步验证了miR-1236对于HCT116细胞活性的变化，发现其结果与CCK-8结果相同（图1C）。随后，通过Ki67实验检测低表达miR-1236后，HCT116细胞增殖能力的变化，结果显示，miR-1236 inhibitor组细胞增殖能力相对于NC对照组明显降低（图1D）。同时，本研究检测了增殖相关蛋白PCNA以及BAX蛋白的变化，发现转染miR-1236 inhibitor后相对于NC对照组，miR-1236 inhibitor 组中PCNA以及BAX蛋白明显下调（图1E～1F）。以上的结果说明，miR-1236能够调节HCT116细胞的活性，同时能够影响HCT116细胞的增殖。

图1 miR-1236对于结直肠癌细胞HCT116活性的影响。1A：逆转录实时定量PCR检测转染miR-1236mimic或者miR-1236inhibitor后miR-1236的表达；1B：CCK-8检测转染miR-1236后HCT116细胞的活性变化；1C：克隆形成检测转染miR-1236后HCT116细胞的活性变化；1D：ki-67检测低表达miR-1236对于HCT116细胞增殖能力的影响；1E～1F：Western blot 检测低表达miR-1236对于HCT116细胞中PCNA 以及Bax蛋白的变化，与对照组相比*P＜0.05

二、miR-1236通过靶向调节FOXO3参与HCT116细胞增殖

为了进一步研究miR-1236对于结直肠癌增殖能力的影响，本研究首先通过生物信息学网站（www.targetscan.org）寻找miR-1236的潜在作用靶点，发现miR-1236与FOXO3有潜在的结合位点（图2A）。同时，luciferase报告结果显示，转染miR-1236-mimic可明显抑制FOXO3a-wt组的荧光素酶活性，而对FOXO3-Mut组没有作用（图2B）。随后，通过免疫蛋白印记方法以及实时定量PCR方法检测分别转染miR-1236-mimic或inhibitor后，FOXO3a蛋白以及mRNA的变化，结果显示，miR-1236-mimic组相对其NC组能够明显降低FOXO3a蛋白以及mRNA的表达，而转染miR-1236-inhibitor后，FOXO3蛋白以及mRNA水平显著上调（图2C～2D）。以上的结果说明，miR-1236与FOXO3a存在靶向调节作用。

三、FOXO3对于结直肠癌的作用

既然，FOXO3a是miR-1236的靶基因，进而影响HCT116增殖能力的变化，那么，FOXO3a在结直肠癌的作用到底是什么呢?本研究通过TCGA网站检测了FOXO3a在结直肠癌中的作用，本研究发现，FOXO3a在结直肠癌组织中相对于正常组织明显降低（图3A）。随后，本研究对于不同阶段的结直肠患者组织进行分析，本研究发现在结直肠癌的第一阶段，FOXO3a表达相对于健康人明显降低（图3B），同时，本研究还对不同性别的患者进行了检测，本研究发现，FOXO3a在男性患者中降低的更为明显（图3C）。为了进一步确认，FOXO3a在结直肠癌中的作用，本研究采用免疫组化方法检测结直肠癌患者中癌-癌旁中的表达，结果显示在结直肠患者中FOXO3a表达相对于癌旁组织表达明显降低。

图2 mir-1236通过靶向FOXO3a基因调节HCT116细胞增殖。2A：TargetScan软件预测，FOXO3a基因与mir-1236潜在种子序列；2B：荧光素酶报告分析；2C、2D：分别转染mir-1236-mimic或mir-1236 inhibitor后FOXO3a的蛋白和mRNA表达。*与对照组相比P＜0.05

讨 论

在临床上，40～50岁年龄组的CRC发生率较高。男性发病率是女性的2～3倍。随着我国人民生活水平的提高和饮食结构的变化，CRC的发病率呈逐年上升的年轻化趋势，严重威胁着人们的健康和生活质量［12］。CRC早期症状不明显，容易漏诊。患者多为晚期，治疗难度大，疗效差，预后差。因此如何诊断预防以及治疗结直肠癌成为广大医学工作者需要解决的问题。

FOXO是一类进化上高度保守的转录因子，广泛参与许多生物过程的调控，如胚胎发育、细胞增殖、细胞周期和凋亡。FOXO转录因子家族共有4个成员，分别是FOXO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6，其中FOXO3是研究最多的核心成员［6-7］。在本研究的结果中发现CRC时FOXO3a表达异常降低，提示其可能具有抑癌作用［8-9］。

同时miR-1236参与多种癌症的生理过程，可通过抑制HDAC3和SENP1表达来调控缺氧诱导的宫颈癌的侵袭和转移［13］，还可以靶向激活p21WAF1/CIP1，抑制肾细胞癌增殖［14］。然而本研究的结果显示miR-1236能够对于结直肠癌细胞活性产生影响，本研究发现过表达miR-1236后能够促进HCT116细胞活性增加，而低表达miR-1236后不仅仅能影响细胞活性，还能使其增殖能力相对于NC对照组明显减弱（图1D～1F），提示本研究miR-1236参与了结直肠癌的病理生理过程（图1）。本研究的结果与Li等［11］人的研究相似，他们报道了，miR-1236能够通过ceRNA方式抑制肝细胞癌的增殖。而后，为了进一步确定miR-1236是如何发挥其作用的，本研究通过生物信息学网站查询了相应的结合位点，发现FOXO3a与miR-1236有相应的结合位点。通过luciferase实验，确定了FOXO3a为miR-1236的靶基因（图2），同时，检测了过表达miR-1236后FOXO3a蛋白以及mRNA水平的变化，结果显示，过表达miR1236能够明显抑制FOXO3a的表达，而低表达miR-1236能够增加FOXO3a的表达。以上的结果提示：结直肠癌细胞系HCT116中，miR-1236通过抑制FOXO3a的表达从而发挥促癌作用，同时，通过TCGA以及免疫组化的方法证明了，FOXO3a在结直肠癌中低表达（图3），而本研究的结果也符合miRNA靶向靶基因的经典作用机制。

总之，本研究结果首次证明了miR-1236对于结直肠癌增殖能力的作用，而miR-1236的作用是直接调控FOXO3a基因进而实现的，同时FOXO3a在结直肠癌中是一个抑癌因子。本研究的结果为miR-1236可能成为结直肠癌患者的一种潜在治疗药物或者靶点提供了有力证据。

图3 FOXO3a在结直肠癌中的表达。3A：TCGA数据库检测FOXO3a在癌症-癌旁中的表达；3B：TCGA数据库检测FOXO3a在不同肿瘤阶段中的表达；3C：TCGA数据库检测FOXO3a与不同性别的表达；3D：免疫组化检测FOXO3a在男性患者中结直肠癌组织中的表达