菠菜叶片中色素的提取和分离

林欢

摘 要：菠菜叶片中富含多种天然色素，天然色素广泛用于各个领域，整个社会对于天然色素的需求量在不断提高，色素的提取和分离方法日益重要。然而提取分离色素仍然面临着耗时长，产能低，环境污染严重等问题。为了寻找解决这些问题的方法，本实验通过薄层层析和柱层析法探究提取分离色素的最佳工艺，并测定各色素Rf值，测绘各色素的紫外光谱图，为后续研究提供数据支撑。通过本次实验发现薄层层析法比柱层析法各具有优势，时间耗时更少，分离效果更为准确，但若要单次分离较多色素则用柱层法。

关键词：菠菜;色素;提取方法;薄层层析;柱层析法

一、前言

绿色植物叶绿体中含有许多天然色素。以菠菜为例，它富含叶绿素，胡萝卜素和叶黄素等多种天然食用色素，其中叶绿素可以作为植物光合作用的催化剂，具有杀菌、除臭、解热、止血等功能;胡萝卜素具有维生素A的生理活性和抗氧化作用，被广泛应用于食品、医药、化妆品及饲料添加剂等方面;叶黄素可抗衰老，抗突变，是天然的食品色素和食品营养剂。这些天然色素在食品、医药等方面运用广泛，在人类社会中发挥着不可替代的作用，社会对天然色素的需求量也在不断地提高。

而随着社会对天然色素的需求量提高，改进和优化色素的提取和分离技术的重要性日益突出，现主要的提取方法主要是利用有机溶剂的提取，由于其所用溶剂多为有毒试剂，仍存在着许多弊端。如今绝大部分的分离法均为色谱法的衍生，其主要包括了薄层层析，吸附柱层析，纸层析法，高效液相色谱法等，这些方法各有优缺点。

基于前人的研究，通过收集数据，发现前人测得的叶绿素，叶黄素和胡萝卜素的Rf值有些许差异。于是在本实验中，我们采用薄层层析和吸附柱层析方法分离菠菜中的色素，比较两种方法的效率差异，测量出各色素的Rf值和测定四种色素的紫外光谱。以供为后续研究者提供数据佐证。

二、实验部分

1.材料与试剂

菠菜叶、硅胶、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、碱性三氧化二铝、无水硫酸钠、中性氧化铝、滤纸、棉花

2.实验仪器

剪刀、研钵、布氏漏斗、圆底烧瓶、分液漏斗、直形冷凝管、 层析柱、抽滤瓶、烧杯、铁架台、脱脂棉、分光光度计、载玻片

3.实验步骤

3.1提取菠菜色素

提取方法大致可分为抽滤法、浸泡法、亚临界萃取、超声波提取以及微波提取等方法。本次实验采取传统的抽滤法来提取色素，其具体步骤如下：取5g新鲜菠菜叶用剪刀剪碎与20ml甲醇搅拌研磨5min，研磨时加入少许二氧化硅和碳酸钙，并加入少量的甲醇然后用布式漏斗抽绿菠菜汁，弃去滤液。然后用石油醚甲醇体积比为3：1的混合溶液对残渣进行萃取，萃取两次。将萃取液转入分液漏斗，用水洗涤两次。弃去水甲醇层和石油醚层用无水硫酸钠干燥，然后过滤再进行水浴。

3.2分离菠菜色素

分离方法大致可分为纸层析法，薄层析法和柱层析等方法。这些操作方法，大体相同且各有优缺点。它们都是色谱法的衍生，色谱法是现代分析化学中重要的分离、分析技术，它是由俄国植物学家茨维特发明的，它的原理为当样品流过固定相时，因样品中不同组分在两相中的分配系数不同，它们的移动速度不同，从而使样品分离。目前而言，绝大部分分离方法都是色谱法的衍生，也许在色谱法之外，有更好的分离方法，但这方面的研究几乎没有。本次实验采取了技术较为成熟的薄层层析和柱层析法来进行分离菠菜色素，以此来对比其分离效率以及效果。

3.2.1薄层层析

利用在载玻片和硅胶，提前准备好层析板。此次实验采用石油醚丙酮8：2和石油醚乙酸乙酯6：4体积比两种混合溶液为展开剂，别进行实验并对比结果。活化薄层板并点样，将其放入加有展开剂的广口瓶内，在内壁贴一张高为5cm 绕周长约4/ 5的滤纸，盖好瓶盖，待展开剂上升到指定高度时取出，根据斑点位置求出Rf值。

3.2.2柱层析

将20×10cm的层析柱石油醚和中性氧化铝填装，将菠菜叶的浓缩液滴加到顶部，然后打开下部活塞，使液面下降至柱面以下1mm左右，再关闭活塞，加入石油醚冲洗内壁，再打开活塞是使液面下降，反复几次使色素全部进入主体带色素全部进入柱体后，在顶部小心加约1.5～2cm高度的洗脱剂在下面用锥形瓶收集。洗脱剂成分为9：1的石油醚丙酮溶液和1：7的石油醚丙酮混合液，分别进行实验并对比结果。将收集到的色素进行紫外光谱测定。

三、结果与讨论

1.测量数据

1.1各色素Rf值

叶绿素b的Rf值=0.38

叶绿素a的Rf值=0.53

胡蘿卜素Rf值=1

叶黄素的Rf值=0.78。

1.2各色素的紫外光谱

叶绿素b在645nm和663nm处都有吸收，但在645nm处吸光系数较大，为45.60，在663nm处较小，为9.27。

叶绿素a在645nm和663nm处皆有吸收，但在645nm处吸光系数较小，为16.75，在663nm处较大为82.04。

胡萝卜素在400nm到500nm之间均有吸收，在500nm处吸光系数较大为56.78，在400nm处吸光系数较小，为25.65。

叶黄素在444nm处有最大吸收峰。

1.3数据分析

综上所得，胡萝卜素的Rf值最大，叶黄素次之，叶绿素a和叶绿素b的Rf值相近。四种色素的紫外光谱有所差异，其中叶绿素a和叶绿素b的最为相似。所测得的实验数据与刘志伟[1]所测的数据较为相似，他测得的数据是在石油醚乙酸乙酯6：4 情况下，胡萝卜素Rf值为0.98，叶黄素为0.82 叶绿素为0.61。在他进行的实验中，并没有区分此叶绿素为叶绿素a还是叶绿素b，根据我们实验所测的数据此结果与测得的叶绿素a的值更为相似，所以可以判断他所测得的是叶绿素a。

2.实验条件的选择和优化

本次实验并未对菠菜色素提取方法进行细致研究，直接采取了最为传统且广泛的抽滤法进行提取。但从实际而言，抽滤法缺点明显，抽滤不好控制，容易使非极性溶剂抽走并且操作复杂，提取纯度较低。与本次实验而言，提取结果对分离结果会产生一定影响。若要提高其纯度，可采取浸泡法、亚临界萃取、超声波提取和微波提取等方法。郭松斌对通过以上方法提取出的色素进行了精密度、稳定性和重复性实验，指出超声波提取和微波提取虽可以提高提取效率，但由于超声波的空化效应，微波的热传导作用不利于天然色素特性的保留，而亚临界萃取过程没有加热，所以他觉得亚临界萃取法相对而言更为适宜[2]本次实验利用甲醇来提取色素，但由于甲醇有毒危险性较高，而乙醇与甲醇极性相距不大，且无毒，所以可以用乙醇来代替甲醇提取色素，此方法更为安全，对提取效果影响不大。所以下次可尝试用亚临界萃取法和乙醇进行实验。

菠菜色素分离方法较多，本次实验只采用了薄层层析和柱层析法。通过对比可得，薄层层析法分离迅速，效果好，斑点清晰而集中，故可以用来快速定性，也被运用在微量分离中。柱层析法分离效果明显，分离量较大，但所需时间较长，吸附剂氧化铝及洗脱剂用量较大，成本较高，操作较难，成功率较低。两种方法各有优缺点，可根据具体需要采取相应方法，以本次实验为例，采取薄层层析法法较为合适。

在运用薄层层析法时，本实验选取了两种展开剂，通过对比得，在不同的展开剂作用下，分离结果有着而显著差异。可见展开剂是影响色谱分离度的重要因素，其原理大致可概括为展开剂的极性越大，对特定化合物的洗脱能力也越大。常用展开剂按照极性从小到大的顺序排列大概为石油醚小于己烷小于甲苯小于苯小于氯仿小于乙醚小于乙酸乙酯小于丙酮小于乙醇小于甲醇小于乙酸。有部分研究者指出以石油醚丙酮苯混合溶液为展开剂时效果最佳，也许未来实验的改进可从此进行。

在运用柱层析法时，我们选用的洗脱剂为9：1体积比的石油醚丙酮溶液，在此条件下各色素的分离速度较快，但分离时色素有叠加效应，分离效果一般，所用溶剂种类多，用量大。刘志伟通过实验提出以石油醚乙酸乙酯3：2为洗脱剂时，分离速度较快，且分离效果较好。[1]

3.误差总结

选取不同的展开剂或洗脱剂均会对所测得的结果产生一定的影响，甚至于改变药剂各成分的比例也会有细微的不同，因此选择合适的展开剂洗脱剂是提取和分离色素的关键。在此基础上，选择合适的提取时间和分离时间也极为重要。若时间太短，则提取不充分，所得的色素相对而言较少，各色素不能完全分离，仍混合在一起。此时测出的各个色素的Rf值和紫外光谱图就存在误差。 若时间太长，则提取的色素有可能会溶解在有机溶剂中 ，从而使提取量变小，也会导致误差较大的情况。因此提取和分离时间的选择，是误差是否存在的重要因素。

结束语

采用了薄层层析和柱层析法对菠菜中色素提取和分离进行了探究，通过对提取溶剂，洗脱剂种类进行研究，探究提取和分离色素的最佳条件，并测定各色素Rf值，测绘各色素的紫外光譜图，为后续研究提供数据支撑。本实验中发现，可以用乙醇来代替甲醇提取色素，可以减少部分对环境的污染。在进行实验对比后发现，石油醚乙酸乙酯6 ：4 体积比，作为展开剂时，相对而言效果较为明显，以9：1石油醚丙酮溶液为洗脱剂，相对而言效果更为明显。当然并不是说以上两种是最佳的展开剂或洗脱剂，还有更好的更高效的洗脱剂或展开剂等着我们去探究，探究方法可以此实验方法为基础进行改进，其所测的数据可与本次实验测得的数据进行对比，以证明所探究试剂对提取色素的准确性。

参考文献

[1]李志伟.半微量-微量技术在菠菜色素提取与分离的中的应用[J].化学教育，2019（40）：55-57

[2]郭松斌. 蔬菜中色素检测及在卷烟中的应用[J]. 食品工业，2017， 38（3）