绿色荧光蛋白瞬时表达的融合蛋白构建方法

王颜

摘要：叶绿体是植物细胞的重要细胞器，是植物光合作用的场所。每个叶绿体蛋白质按照其功能分布在叶绿体的不同区域。根据结构组成和生化特性将叶绿体分成3个部分，叶绿体被膜、叶绿体基质和类囊体。植物蛋白的亚细胞定位是功能基因组学的重要内容。近几年来，常用的叶绿体蛋白质亚细胞定位方法是以GFP及其突变体为报告基因的融合报告基因定位法。综述了基于绿色荧光蛋白瞬时表达的融合蛋白构建方法以及植物材料选择，同时进行比较和分析，并改进不足之处。

关键词：叶绿体蛋白质；融合蛋白构建

叶绿体是植物所特有细胞器，是光合作用的重要场所。据估计在高等植物中大约有21000-25000个蛋白，叶绿体蛋白占蛋白总数的10%-25%[1]，充分说明了叶绿体对植物的重要性。由于叶绿体是半自主性细胞器，其叶绿体蛋白大部分都是由核基因编码，小部分由叶绿体基因编码[2-3]。叶绿体蛋白主要分为以下几种，叶绿体膜蛋白、叶绿体基质蛋白、类囊体膜蛋白和类囊体腔蛋白。根据生化特性以及结构组成将叶绿体分为以下3个部分：由内被膜和外被膜构成的叶绿体被膜、叶绿体基质、类囊体膜和类囊体腔组成的类囊体[4]。

本研究对近几年常用的叶绿体蛋白质亚细胞定位融合蛋白构建方法以及植物宿主载体选择归纳总结、提出优缺点并对不足之处进行改进，为得到更高效的叶绿体蛋白质亚细胞定位方法提供信息。

1.融合蛋白构建方法

1.1农杆菌转化法

农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。其转化原理是将携带外源基因的DNA插入到Ti质粒的T-DNA区，借助农杆菌感染组织细胞，使外源基因整合到植物的基因组中，再利用细胞和组织培养技术得到转基因植株[5]。从当前国内外研究现状来看，叶绿体蛋白质定位的植物瞬时表达系统中，农杆菌转化技术的浸花法和叶片注射法应用较为广泛。

1.1.1浸花法

浸花法是近几年发展起来的一种快速、高效、稳定的非组织培养转基因方法，是由Clough和Bent在真空渗透法的基础之上演变而来[6]。真空渗透法是将农杆菌菌液与植株放置在真空条件下进行侵染，而浸花法不需要进行真空处理，只需将农杆菌菌液与植株直接接触即可。

1.1.2注射法

收集农杆菌菌液于2mL离心管，4000r/min离心5min，去上清，加0.8mL重悬液（MES 2.132g/L，MgCL2？6H2O 2.033g/L，pH=5.6，使用前加入200μmol/L乙酰丁香酮，50mL LB液体培养基加100μL乙酰丁香酮）重新悬浮；菌液浓度OD600值调整到0.8，放置1-3h；用無菌注射器将菌液注射到烟草叶片的下表皮，喷适量水，套保鲜袋，放置在22℃的温室中，用19h的光照和6h的黑暗交替培养；次日揭保鲜袋，培养3-7d，用激光共聚焦显微镜观察[10]。

1.2 PEG转化法

PEG（聚乙二醇）是1种高分子化合物，在20%-25%的浓度下去壁的受体细胞原生质体迅速缩水，细胞膜结构发生变化，在细胞膜结构发生不可逆破坏前去掉PEG，细胞膜结构就会又回复到稳定状态。

在此过程中，由于PEG可以与Ca2+等阳离子连接，Ca2+能在PEG和带负电荷的质粒DNA之间形成桥，从而促进外源基因进入到原生质体内[12]。该方法的详细过程是，用解剖刀将幼嫩的叶片切成约0.5mm2大小的丝状，放入10ml的酶解液中处理，酶解液为CPW盐溶液加入了纤维素酶R10、离析酶MR10、甘露醇和MES，pH调制5.8，真空处理30min，在26℃气浴恒温振荡器内40r/min避光震荡；用过滤网洗去未完全消化的沉淀物，700r/min离心5min；采用 PEG法转化原生质体，100μL原生质体溶液和10μg质粒，然后加入110μL 50%PEG溶液（9.1%甘露醇、10% CaCl2、40%PEG4000）慢慢混匀静置30min，用W5溶液将混合物再次清洗3次，清洗后将混合物放置在25℃条件下暗培养16h，使用激光共聚焦显微镜观察观察基因表达情况.

2.结论与展望

由于叶绿体自带红色荧光，在亚细胞定位时要选择与红色反差较大的绿色或黄色荧光蛋白基因构建表达载体。烟草和拟南芥都是表达外源植物基因常用的遗传转化材料，苗龄6-8周的烟草叶片和苗龄3-4周的拟南芥叶片，叶绿体含量多，细胞活性强，容易观察。叶绿体蛋白质亚细定位与功能发挥紧密联系，细胞功能的发挥需要不同分区蛋白质之间的相互作用、修饰以及动态变化等调控活动来体现。因而，从静态定位研究发展到动态定位研究，成为蛋白质亚细胞定位研究的新挑战。随着转化方法的改进、研究技术的提高以及数据库的不断完善，叶绿体蛋白质定位和功能的研究会更加清晰。为进一步对叶绿体在植物生长发育，遗传代谢的相关研究打下了基础。

参考文献：

[1]Ouyang M， Li X， Ma J， et al. LTD is a protein required for sorting light-harvesting chlorophyll-binding proteins to the chloroplast SRP pathway[J]. Nature Communications， 2011， 2（1）：277.

[2]齐欣， 崔继哲， 朱宏. 叶绿体的蛋白质组学研究进展[J]. 现代生物医学进展， 2007， 7（3）：440-442.

[3]Wijk K J V. Proteomics of the chloroplast： experimentation and prediction[J]. Trends in Plant Science， 2000， 5（10）：420-425.

[4]王金辉， 李轶女， 刘惠芬，等. 叶绿体蛋白质组学研究进展[J]. 生物技术通报， 2011（2）：1-6.

[5]邢浩然， 刘丽娟， 刘国振. 植物蛋白质的亚细胞定位研究进展[J]. 华北农学报， 2006， 21（s2）：000001-6.

[6]徐芳， 熊爱生， 彭日荷，等. 植物遗传转化的新方法：Floral DiP[J]. 中国蔬菜， 2005， 1（3）：29-31.

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[8]党智笙， 肖成斌， 马燕林，等. 农杆菌介导的浸花法（Floral-dip）存在的问题及对策[J]. 中国食品工业， 2014（6）：58-58.

[9]Clough S J， Bent A F. Floral dip： a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.[J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology， 1998， 16（6）：735–743.

[10]高建强， 梁华， 赵军. 植物遗传转化农杆菌浸花法研究进展[J]. 中国农学通报， 2010， 26（16）：22-25.