透射电子显微镜在生物大分子结构与功能研究中的应用

梁昂昂

摘 要：透射电子显微镜的基本原理和主要的两种样品制备方法，冷冻电镜技术和负染色技术。

关键词：TEM ，CRYO-EM ，NS-EM

1932年德国科学家Ruska研制出以电子束作为光源的透射电子显微镜，得益于电子显微镜远高于光学显微镜的分辨能力，人类第一次看到细胞及其内部器官的细节，病毒的结构。随着对生物体微观结构的探索，电子显微镜也随之显示出巨大的潜力。

迄今为止，电子显微镜获得的三维信息仍然依赖于物体的透射二维图像，即通过得到大量从不同角度获取的投影，从而重建物体的三维结构信息。

（一）透射电子显微镜成像原理

简单地说，透射电子显微镜是以电子束作为照明光源的显微镜，其实质是通过外部电磁场作用使电子束产生弯曲，从而形成电子束“透镜”。由于经过高电压加速的电子波长很短，所以电子显微镜的分辨率要大大高于传统的光学显微镜。事实上，现代电子显微镜的分辨率已经达到了1？的水平（但是相较于电子的波长，电子显微镜的分辨本领仍然有很大的潜力）。

一般来说，透射电子显微镜的工作原理是：由电子枪发射出电子束，经过被抽成高真空状态的镜腔通道中，沿光轴方向通过聚光镜，然后电子束会聚成一束很细且亮度均匀的光斑，照射在放置于样品室内的样品上；入射电子与样品会发生各种各样的相互作用，除了直接透过的电子，其他电子将会和样品内部原子发生相互作用而被散射，因为不同的原子和不同的作用距离会影响电子的空间出射角度，因此透过样品后的电子束将携带样品内部的结构信息；然后通过物镜的会聚调焦，且应用光阑把将弹性散射电子阻挡后，电子束被初级放大，然后进入下级中间透镜并和投影镜系统进行进一步的放大成像，最后将被放大了的电子影像投射在观察室内的荧光屏上，供使用者观察，并可被CCD记录。

在电子显微镜成像过程中，由于电子显微镜中各器件的影响，从傅立叶空间中看，样品的振幅和相位信息将被电子显微镜调制，从而在成像过程中附加仪器信息。这些额外的信息可以通过所谓的衬度传递函数（CTF）来表示，其主要参数包括电镜的球差系数，电子的波长，欠焦值和频率值等，其形状类似随频率而变化的正弦波。再加上由于电子束干涉质量、能量扩散、色差、电流和电压不稳定引起的频率衰减效应，导致频谱空间将有一个类似衰减正弦波的调制函数，该调制函数与物体的频率信号叠加后，就是最终的物象信息。

当然，作为一种探测仪器，仪器的状态当然非常重要，但更重要的是能够制备出厚度较为适宜且品性良好的生物大分子电镜材料样品。

（二）生物大分子电镜样品的制备方法

为了保证电子显微镜中电子光路的稳定性并消除由空气引起的电子散射，电子显微镜内部都是高真空环境。理想情况下，生物大分子需要存在于完全适应本体真实生活环境的溶液中。这就产生了一个矛盾：电子显微镜的高真空与生物样品的自然生存环境之间的矛盾。为了解决这一问题，必须开发特殊的生物样品制备方法和合适的样品载体以及相应的电子显微镜装置。下面简要介绍两种当前最主要的生物大分子电镜样品的制备方法：冷冻电镜法和负染色法。

1）冷冻电镜技术（cryo-electronmicroscopy）

冷冻电子显微镜，简称冷冻电镜，是指将生物大分子快速冷冻后，在低温下用透射电子显微镜对样品进行成像，并通过图像处理和重构计算得到样品的三维结构。单颗粒低温电子显微镜技术可以观察到少量的非晶态生物样品，获得高分辨率的图像，因此，冷冻电镜技术已成为研究生物大分子结构的重要手段。

冷冻电镜样品制备的基本流程是将载有样品的电子显微镜网格快速投入冷却的液态乙烷中，在载网孔或支持膜中形成玻璃态的冰，样品颗粒（ 粒径大约十几到过百纳米）分布在其中，形成冷冻样品。玻璃体生物样品可进一步制备成超薄切片，在冷冻电镜下可观察到近乎活体的超微结构。高压冷冻样品制备技术避免了样品中可溶性成分的提取、丢失和移位，使研究人员能够直接观察到接近生存状态的细胞和组织的自然形态。

电子束辐照引起的损伤取决于电子剂量、样品的温度和电子束的能量。生物样品的性质决定了必须采用低剂量电子成像技术。对超低温样品的观察，不仅解决了样品中水分含量的问题，而且减少了电子辐照和温度提升对生物样品的损伤。然而，这种低剂量成像的最大问题是单张电子显微镜图像的信噪比较低，照片衬度低，由此导致图像模糊。因此，新的成像设备和强大的图像处理系统对冷冻电镜的发展至关重要。2012-2013年，电子直接检测相机（ electrondirect detection device，DDD）的应用使冷冻电镜突破了技术难关。DDD相机能直接探测高能电子，使信噪比和空间分辨率大大提升。

2）负染色电镜技术（NS EM）

负染色法最早由Brenner和Horne在1959提出。作为一种传统的制备电镜样品的方法，负染色技术因其简单、快捷、成像衬度高等优点而得到广泛应用。这种方法主要用染色剂中的重金属粒子沉积在大分子周围，使大分子被包埋起来，这相当于重金属层形成一个中空的大分子轮廓（由于重金属的分子量较大，大分子物质将近似为空白物），由于重金属粒子的渗入效应，有时甚至可以显示出大分子的内部结构。

一般生物样品负染操作的流程是：将浓度符合要求的样品溶液滴在经辉光放电处理后的载物片上，并保持一段时间（约1分钟）；然后将多余的溶液除去，然后迅速滴上染色剂，并使染色剂与生物样品颗粒充分接触（反应数十秒至数分钟），把多余的染色剂吸除后干燥即可。

现如今，虽然冷冻电镜被广泛使用，负染色技术仍然被广泛应用于高分辨率电子显微镜的结构研究中。事实上，冷冻三维结构研究的最初阶段大多要先经过负染电镜研究，有时研究时长长达数年。

（三）基于透射电镜的生物大分子三维结构重构

仅凭借生物大分子的氨基酸序列并不能够完全揭示大分子的功能原因。事实上，正是这些氨基酸序列的三维结构决定了生物大分子的功能状态。因此，如果要研究生物大分子的功能，就必须了解它的结构。在此基础上，随着计算生物学的迅速发展，X射线晶体学、核磁共振（NMR）和电镜技术已成为当今生物结构检测的主要手段。

然而，X射线晶体学需要多维结晶的样品，核磁共振则需要样品有序，且对样品分子量有一定限制。电镜方法则可以不需结晶，并对分子量没有限制，而且还可以采用瞬时冷冻的方法保持生物大分子的天然活性，甚至可以單独观察并重构任意一个大分子的三维结构，从而显示出其独特的优势。

参考文献：

胰蛋白结构与功能的透射电子显微镜研究 张磊

冷冻电镜技术：从原子尺度看生命 杨慧，李慎涛，薛冰

冷冻电镜单颗粒技术解析生物大分子结构综述 张世超，欧阳燕，刘善辉，朱莉