试析微生物分类鉴定技术在白酒酿造领域的应用

王毅

摘 要：很多现代微生物技术都已经被用在白酒酿造之中，本文对几种当前广泛应用的方式进行了介绍，尤其对以PCR为基础的DNA指纹图谱分类鉴定技术做了重点的介绍和说明，并且说明了几种鉴定技术在当前白酒酿造领域方面的应用情况，希望可以有助于以后对于微生物群落进行研究奠定基础，进而推动我国白酒酿造技术的进一步发展。

关键词：基因；微生物；多样性；菌株；分离

我国酿造白酒的历史由来已久了，其酿造环境有很多外在的影响因素可能会影响到白酒生产的质量，其中最空气、水源和土壤等等都会影响到环境微生物的构成，而在发酵过程中，窖泥和微生物环境共同决定了微生物多样化的情况，进而对传统白酒的产品风格带来了一定程度的影响。把现代微生物技术和传统的白酒酿造技术结合起来，并且在发酵工艺中进行推广应用，就能够进一步推动我国白酒酿造技术的发展，弥补技术和理论方面的空白。

1 传统的微生物鉴定分类的方法

传统的微生物分类坚定方式就是用最直接的方式来鉴定白酒中的微生物。过程按照先后顺序分为5个步骤，分别是采样、计数、培养和分离以及最后的鉴定。首先在采集步骤们对于不同部分都采集一部分样品，包括酒曲、酒醪、窖泥以及周围的水和空气。对样品中的微生物进行计数就是第二个阶段了。这个阶段主要有三种方式可以进行。第一种最为简便快捷的就是显微镜法，但是这种方式无法区分死菌和活菌。第二种是活菌计数方式，可以直接显示活菌的数量，即有繁殖能力的微生物群，第三种是最大可能计数法，这种计数方式可以用来测定具有特殊功能的菌群。第三个步骤是富集培养，富集培养阶段起到的作用是扩大微生物的数量，增加可以研究的样本，为接下来的研究打好基础。第四个步骤是把菌群分离，其方式是进行平板划线，采用的是梯度稀释的方法，这样就可以实现分离菌群的效果，更加方便研究。最后一个步骤是生化实验，按照相应的手册和规范，对菌落进行生化试验，然后将试验的结果运用显微镜来进行观察，最后坚定菌株，这样就完成了微生物鉴定的工作

2 基于PCR的DNA指纹图谱分类鉴定技术

生物技术在近年已经在分子水平方面得到了完善，其中PCR技术进步最为明显，这样一来，就可以用分子来鉴定微生物了。和旧有的坚定方式相比，方式更为快速、结果更为简便，并且也可以直接将未知的微微生物检测出来。

2.1 PCR-DGGE克隆分析技术

这种技术也可以称之为聚合酶链式反应和变性梯度凝胶电泳技术。其中聚合酶链式反应的用处是对体外特异性目的片段进行扩增。而变形梯度凝胶电泳技术的原理是在聚丙烯酰胺凝胶里加入尿素添加剂和变性剂甲酰胺，这样就会直接形成一个线性梯度，其排列方式是从低到高。在相同的温度下，DNA的解链速率不同就会产生不同的电泳迁移率。通过电泳区别率方面的区别，就可以分离出DNA片段。之后把条带中的DNA通过PCR的形式进行扩增，就可以进行微生物分类方面的鉴定了。

2.2 SSCP技术

这种技术是根据DNA具有多态性这一特点，并且结合上文提到的PCR技术，就可以分析遗传学方面的特征。霉菌全长的ITS区序列包含了不同的序列，以及中间的ITSI和ITS2区的完整序列，信息是很丰富的，所以全场序列的分析技术经常被用来鉴定霉菌分子生物。

2.3 末端限制性片段长度分析（T-RFLP）技术

T-RFLP是一种分析生物群落的指纹技术，用于鉴定分析不同微生物群落结构以及它们的多样性。方法是将真菌或细菌设计一对合适的引物，并用荧光物质对引物的一端进行标记，经PCR扩增和酶切后用特定的自动测序仪进行测序。根据检测到的带有荧光标记的DNA片段与相应数据库进行比对判断微生物区系多样性，可以鉴定到微生物种和属；根据荧光强度的强弱可以确定该种的丰度。

2.4 扩增片段长度多态性（AFLP）分子标记技术

扩增片段长度多态性标记技术是建立在RFLP基础上的选择性聚合酶链反应，利用可产生粘性末端的限制性内切酶酶切研究对象的基因组序列，产生不同长度的酶切片段。将这些酶切片段与含有与其有共同粘性末段的人工接头连接，形成模板，再在模板末段添加具有选择性核苷酸（1～3个）的不同引物，然后PCR扩增，结果只有那些两端序列与选择性核苷酸配对的酶切片段被扩增。

3 磷脂脂肪酸法分类

这种方式最早在上个世纪七十年代后期开始研究了，在用途上用来分析微生物的定量。这种分析方式对于旧有的方式存在的缺点都有所弥补，可以直接对微生物中的复杂群落进行研究，总体上来说，检测存在着快捷和可靠的优势。在进行测定的时候可以通过磷脂脂肪酸的种类的不同，对于不同菌类繁殖能力进行研究。通过相关的图谱分析还可以定性和定量分析微生物种类群，就可以确定类群的数量和种类。此外这种方式还经常用来对活体微生物群落进行标记，一般认为生物体细胞内是恒定的，所以对于微生物变化的过程，这种方式可以直接进行揭示。

4 Biolog微平板

Biolog技术由美国Biolog公司于1989年开发成功，最初應用于纯种微生物的鉴定，至今已经能够鉴定包括细菌、酵母、霉菌在内的近2000多种病原微生物和环境微生物。Biolog微平板可以用于估价微生物群落代谢多样性和功能多样性的研究，与其他鉴定系统相比，Biolog方法在用于环境微生物的研究时，灵敏度高，分辨力强，并且数据的读取和记录可以由计算机辅助完成，自动化和标准化程度增高，简化了鉴定程序，提高了鉴定效率。

5 基因序列的同源性分析技术

5.1 16SrRNA/rDNA序列分析1

6SrRNA/rDNA序列分析已经成为了细菌种属鉴定和分类的标准方法。通过将待测菌株的16SrDNA序列进行扩增、测序并进行数据的同源性比对分析。然后按照一定的标准，把测序结果分成若干个操作分类单元。然后将OTU所代表的序列提交到GenBankBLAST数据库中，通过寻找相似度最高的16SrDNA序列，并构建系统发育树，就可以对菌株进行准确、迅速而科学的定位。

5.2 18SrRNA/rDNA序列分析原核生物细胞中的16SrDNA和真核生物细胞中的18SrDNA的碱基序列都是十分保守的，并且不受微生物所处环境条件的影响。因此，通过分析比较微生物种之间16SrDNA和18SrDNA的同源性，可以真实的揭示它们的亲缘关系和系统发育地位。对于真核生物而言，18SrRNA可以鉴定其系统发育地位。

结束语

如果想要了解白酒酿造中的微生物的多样性和数量以及其变化规律，就少不了对制曲工艺和酿造环境等因素进行分析，进而对不同窖龄的白酒都进行有效的分类和坚定。本文介绍了几种鉴定白酒中微生物的方式，并且对发酵过程中微生物的演变情况做了研究，希望可以让白酒发酵方面的理论更为完善。进而为未来的微生物变化差异的研究奠定了基础，也有利于研究霉菌和细菌的变化差异，有助于酿制出不同风格、不同品味的白酒。

参考文献

[1]吴莉莉，王海燕，徐岩，王栋.酱香型与清香型白酒发酵过程中乳酸菌菌群的差异性分析[J].微生物学通报，2013（12）.

[2]刘森，李林光，李可，贾碧洪，钟小廷，车振明，向文良.中国浓香型白酒窖池窖泥中原核微生物群落的空间异质性[J].食品科学，2013（21）.

[3]刘琨毅，卢中明，郑佳，赵金松，黄钧，周荣清.浓香型白酒窖泥微生物群落PLFA指纹图谱方法[J].应用与环境生物学报，2012（05）.endprint