磷酸奥司他韦胶囊有效成分含量测定方法研究

陈丽，马书玉

摘 要：目的：通过文献及方法学研究确立磷酸奥司他韦胶囊有效磷酸奥司他韦的含量测定方法。方法：HPLC法。色谱柱为全多孔硅胶微粒健合C8色谱柱（46mm×25cm，5？滋m）；流动相为甲醇：乙腈：磷酸二氢钾-氢氧化钾缓冲溶液（245：135：620）；等度洗脱；流速：1.2ml/min；UV检测波长：207nm；进样量：15μl；色谱柱温度：50℃。结果：有效成分磷酸奥司他韦进样量在3.0234～30.234μg与峰面积A呈良好的线性关系（r值0.9999），加样回收率为99.67%，RSD为1.10%；结论：方法学试验结果表明该方法测定磷酸奥司他韦胶囊含量准确、可靠、重复性好。

关键词：磷酸奥司他韦胶囊；HPLC；含量测定

磷酸奥司他韦胶囊最早在1999年10月上市，原研药商品名达菲，生产厂家为罗氏制药。磷酸奥司他韦是其活性代谢产物的药物前体，其活性代谢产物（奥司他韦羧酸盐）是选择性的流感病毒神经氨酸酶抑制剂。神经氨酸酶是病毒表面的一种糖蛋白酶，其活性对新形成的病毒颗粒从被感染细胞中释放和感染性病毒在人体内进一步播散至关重要。磷酸奥司他韦的活性代谢产物能够抑制甲型和乙型流感病毒的神经氨酸酶活性。在体外对病毒神经氨酸酶活性的半数抑制浓度低至纳克水平。在体外观察到活性代谢产物抑制流感病毒生长，在体内也观察到其抑制流感病毒的复制和致病性。本品通过抑制病毒从被感染的细胞中释放，从而减少了甲型或乙型流感病毒的播散。对自然获得的和实验室性流行性感冒进行的研究显示：应用磷酸奥司他韦并没有影响人体对感染产生正常的体液免疫反应。对灭活疫苗的抗体反应并没有受磷酸奥司他韦治疗的影响。目前国内市面上主要有罗氏生产的达菲和国产达菲即磷酸奥司他韦胶囊两种。

本文参考了国内外约17篇文献以及美国36版药典，通过方法学验证建立了磷酸奥司他韦的含量测定标准。

1 仪器与材料

高效液相色谱仪：Waters2694-2996型，分析天平：METTLE XS205型。磷酸奥司他韦对照品（批號101096-201502）由中国药品生物制品检定所提供。流动相用甲醇、乙腈为色谱纯；磷酸二氢钾和氢氧化钾为分析纯；水为超纯水；样品磷酸奥司他韦胶囊为公司自制（中试级）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[1]：

色谱柱：全多孔硅胶微粒健合C8色谱柱（46mm×25cm，5？滋m）；柱温：50℃

溶液A：将6.8g磷酸二氢钾溶解在980mL水中。用1M氢氧化钾溶液调节至pH6.0，用水稀释至1L。

流动相：甲醇：乙腈：溶液A（245：135：620）。

稀释剂：甲醇：乙腈：水（245：135：620）。

波长：207nm。

流速：1.2ml/min，进样量：15μl。

2.2 对照品储备液、对照品溶液制备

对照品储备液：称取磷酸奥司他韦对照品100.78mg，置10mL量瓶中，加入稀释剂使溶解并定容至刻度，制得10mg/ml的对照品储备液。

对照品溶液：精密量取上述对照品储备液1ml至10ml容量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备：取磷酸奥司他韦胶囊20粒，取内容物混匀并研成细粉，精密称取该粉末（约相当于奥司他韦50mg），置50mL容量瓶中，加入稀释剂20ml适量，超声波处理20分钟，放冷，加稀释剂至刻度后，摇匀，离心，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，作为供试品溶液。

按照2.1项色谱方法进行测定。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性关系考察

精密量取对照品溶液储备液0.2ml，0.6ml，1ml，1.4ml，1.8ml，2.0ml置10ml容量瓶中，分别加稀释剂至刻度，摇匀，制成0.2、0.6、1、1.4、2.0mg/ml的对照品溶液（线性考察）。按上述色谱条件进行测定，以对照品溶液浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标，制得标准曲线，考察线性关系，计算回归方程得：A=959265C+3093.8 r=0.9999。试验结果如下表1。

结果表明：磷酸奥司他韦浓度（以奥司他韦计）在0.2016～2.0156mg/ml（进样体积15μl），即进样量在3.0234～30.234μg范围内，线性关系良好。

2.4.2 精密度试验：精密量取磷酸奥司他韦对照品溶液依照2.1项色谱条件连续进样6针，每针15μl，记录色谱图及峰面积，以6针峰面积的相对标准偏差为评测指标，考察精密度。结果：磷酸奥司他韦对照品溶液连续进样6次，峰面积相对标准偏差RSD结果为0.35%小于2%，说明精密度良好。

2.4.3 重复性试验：按照上述2.3项供试品溶液制备方法，取同一批次磷酸奥司他韦胶囊样品（规格75mg，批号1701071）平行制备6份供品试液， 取供试品溶液及对照品溶液各15μl，分别进样，记录色谱图，计算磷酸奥司他韦的含量。结果：6平行份样品的磷酸奥司他韦含量RSD值为 0.92%，小于2%表明供试品制备方法可靠稳定，方法重复性良好。

2.4.4 回收率试验：取磷酸奥司他韦胶囊20粒（批号1701071），取内容物混匀并研成细粉，精密称取该粉末（约相当于奥司他韦25mg）及对照品按高、中、低三个量（每个量3个平行样，共9份样品）分别置于9个50mL容量瓶中，分别加入稀释剂20ml适量，超声波处理20分钟，放冷，加稀释剂至刻度后，摇匀，离心，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，作为供试品溶液。分别精密量取本项下供试品溶液和上述2.2项下对照品溶液各15μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，外标一点法计算得出含量和回收率。磷酸奥司他韦的加样回收率（以奥司他韦计）结果：低浓度回收率平均值为99.49%，中浓度回收率平均值为98.68%，高浓度回收率平均值为100.83%。所有结果均在98.41%～101.72%之间，高中低三个浓度9个供试品回收率数据的平均值为99.67%，RSD为1.10%小于2%；所有结果均符合要求，标明该检验方法准确、可靠。

2.5 样品测定

应用上述建立的磷酸奥司他韦含量测定方法对稳定性研究用自制中试级别的四批磷酸奥司他韦胶囊样品的含量进行测定，测定结果分别为：75.05mg/片、75.02mg/片、75.09mg/片、75.11mg/片，结果均符合规定。通过实际测定，进一步验证了方法得可靠性。

3 讨论

通过方法学验证试验建立了磷酸奥司他韦胶囊含量测定方法。并证明该方法稳定可靠。另外，在研究实验过程中主要遇到以下两个问题值得讨论。一是部分文献使用C18色谱柱，而美国药典选择了C8色谱柱。二者的区别在于C18色谱柱碳链更长，保留性更好，C8高疏水性分析物、类固醇、脂类等大分子样品分析；而C18则适合中等极性、非极性等小分子样品分析。因此，对于磷酸奥司他韦，选择C8更为合理。二是部分文献流动相的水相为磷酸钠盐，而美国药典为磷酸二氢钾。通过比较试验，对于磷酸奥司他韦的分析，只要二者摩尔浓度一致，对色谱表现没有明显区别。

参考文献

[1]美国药典，USP36.