甲烷氧化混合菌胞内PHB提取方法的优化

王喆等

摘 要：本文通过考察甜菜碱和EDTA二钠盐对PHB提取收率的影响，确定了甜菜碱和EDTA二钠盐在甲烷氧化混合菌胞内PHB提取工艺中的最优用量。

关键词：PHB；甜菜碱；EDTA二钠盐

PHB以其生物降解性、生物相容性、压电性、光学活性以及在生物合成过程中可利用再生资源等特性，在药学、医学、农业、电子等领域具有独特而广阔的应用前景，但目前未能实现PHB的大规模工业生产[1，2]。本文通过考察甜菜碱和EDTA二钠盐对PHB提取收率的影响，确定甜菜碱和EDTA二钠盐在甲烷氧化混合菌胞内PHB提取工艺中的最优用量，提高收率，建立甲烷氧化混合菌胞内PHB提取的新方法：表面活性剂（甜菜碱）-螯合物（EDTA二钠盐）提取法，探索简单、无毒，无污染的新工艺提取PHB。

1 材料和方法

1.1 材料

混合菌群Methylococcus capsulatus HD6T从黑龙江省大庆油田富含沼气地区的土壤中培养筛选获得。

1.2 PHB的氯仿提取法

取发酵的菌液，4℃，9000r/min下离心10min，用蒸馏水洗涤2次，再次离心收集菌体，烘干至恒重。在菌体中加入浓度为80%甲醇水溶液搅拌， 60℃水浴1h。水浴后的菌体以转速9000r/s，温度4℃，离心15min。离心后收集细胞烘干。干细胞加入氯仿， 80℃水浴回流萃取1h。所得液体用分析滤纸进行过滤，用氯仿洗3次，旋转蒸发得到纯化的PHB，用浓硫酸法测定含量。

1.3 浓硫酸法测定PHB含量

浓硫酸与PHB 100℃时水浴10min，浓硫酸与PHB在加热时可以定量转化为巴豆酸，巴豆酸在235nm处有一最大吸收峰值，通过紫外分光光度计测定OD235值确定PHB的量。

1.4 甜菜碱法提取PHB条件的优化

表面活性剂甜菜碱（0.6-3mg），螯合物乙二胺四乙酸二钠盐即EDTA二钠盐（0-1mg），溶解于50ml去离子水中，用5mol/L的NaOH调节PH值至13，加入甲烷氧化混合菌干细胞，于50°C以1200rpm的转速进行细胞破壁处理20min，将离心得到的沉淀物质用去离子水和丙酮各洗涤一次，于70°C恒温干燥箱内烘干，纯化的PHB用浓硫酸法测定含量。

以同一批培养的甲烷氧化混合菌干细胞为实验材料，先通过较准确的氯仿提取法提取PHB，再用甜菜碱法提取PHB，将甜菜碱法提取的PHB含量与氯仿法提取的PHB含量进行比较，考察甜菜碱法提取PHB的收率，确定甜菜碱法最佳提取条件。

2 结果与讨论

2.1 不同的甜菜碱对细胞干重比对PHB提取量的影响

离心收集细胞，放于70°C恒温干燥箱内干燥，将干燥后的细胞在此条件下反应：表面活性剂（甜菜碱）对细胞干重比分别为 0.03、0.06、0.1、0.15、0.2、0.3，螯合物（EDTA二钠盐）对干重比为0.1：1，加入去离子水，pH值调至13，于50°C下以1200rpm的转速进行细胞破壁处理20min，将离心得到的沉淀物质用去离子水和丙酮各洗涤一次，于70°C恒温干燥箱内烘干。将烘干后得到的PHB与浓硫酸在100°C下水浴10min， 再测定OD235值，计算出PHB的含量，与氯仿法提取PHB的含量做比较，计算出提取收率。当表面活性剂（甜菜碱）对细胞干重比为0.09：1时，PHB的提取收率最大，为90.33%。

2.2 不同的EDTA二钠盐对细胞干重比对PHB提取量的影响

离心收集细胞，放于70°C恒温干燥箱内干燥，将干燥后的细胞在此条件下反应：表面活性剂（甜菜碱）对细胞干重比为0.1：1，螯合物（EDTA二钠盐）对干重比分别为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1，加入去离子水，pH值调至13，于50 ° C下以1200rpm的转速进行细胞破壁处理20min，将离心得到的沉淀物质用去离子水和丙酮各洗涤一次，于70°C恒温干燥箱内烘干。将烘干后得到的PHB与浓硫酸在100°C下水浴10min， 再测定OD235值，计算出PHB的含量，与氯仿法提取PHB的含量做比较，计算出提取收率。结果见图1，当螯合物（EDTA二钠盐）对干重比为0.08：1时，PHB的提取收率最大，为96.22%。

3 结论

通过用传统的氯仿提取法提取出的PHB含量为基准，采用 PHB含量相同的甲烷氧化混合菌干细胞为实验对象，以提取收率为指标，优化了甜菜碱-EDTA二钠盐的提取条件。当表面活性剂（甜菜碱）对干重比为 0.1：1，螯合物（EDTA二钠盐）对干重比为0.08：1时，提取收率最高。以此优化的甜菜碱和EDTA二钠盐用量，加入去离子水，pH值调至13，于50°C下以1200rpm的转速进行细胞破壁处理20min，将离心得到的沉淀物质用去离子水和丙酮各洗涤一次，于70°C恒温干燥箱内烘干，得到了纯化的PHB，从而建立了简单、无毒，无污染的甲烷氧化混合菌胞内PHB提取的新方法。

参考文献：

[1]Berger E， Ramsay B A， Ramsay J A， et al.PHB recovery by hypochlorite digestion of non-PHB biomass[J]. Biotechnology techniques， 1989，3（4）：227-232.

[2]Ramsay J A， Berger E， Voyer R， et al. Extraction of poly-3-hydroxybutyrate using chlorinated solvents[J]. Biotechnol.Tech， 1994，（8）：589-594.

[3]尹进，沈忠耀.利用噬菌体破细胞壁分离胞内产物的展望[J].生物工程进展，2000，20（6）：9-13.

[4]Berger E.， Ramsay B.A.， Ramsay J.A.， and Chavaric[J]， Brotechnology Techniques， 1989， Vol.3， No.4. ：227-232.