受灭鲑气单胞菌感染的大西洋鲑编码的可溶性TLR5转录编码鉴定

胡 青 刘 敏

(西华大学外国语学院 四川 成都 610000)

受灭鲑气单胞菌感染的大西洋鲑编码的可溶性TLR5转录编码鉴定

胡 青 刘 敏

(西华大学外国语学院 四川 成都 610000)

本文翻译自Elseviers收录文章Identification of a transcript encoding a soluble formof toll-like receptor 5(TLR5)in Atlantic salmonduring Aeromonas salmonicida infection

脊椎动物和昆虫的Toll样受体(TLRs)在先天免疫应答中与抗微生物病原相关。TLR的胞外区识别病原相关分子模式，胞内区启动免疫反应的信号途径。在染病大西洋鲑肝脏中发现一种新可溶性TLR转录物。BLASTN分析显示其与最近在虹鳟中发现的可溶性TLR5(Genebank：AB062504)具有最高序列相似度。推导出蛋白质与哺乳动物TLR5对应的类富含亮氨酸区域(LRR)有40%的相似度。依照人类TLRs结构，它含21个LRRs保守区域，LxxLxLxxNx*xx*xxxxFxxL模式。由于TLR5可识别细菌鞭毛蛋白，可推测，灭鲑气单胞菌鞭毛蛋白或其他一些配体衍生物与LRR中某区域结合到这种可溶性TLR。

可溶性Toll样受体(TLR);亮氨酸富集重复(LRR);炎症;大西洋鲑

先天免疫系统是抵抗病原体的首个防线，TLRs是其中识别病原体不可缺的部分。TLRs识别入侵的病原体保守的病原相关分子模式，继而通过相互作用的几个信号转导通路引起宿主细胞的炎症反应和免疫反应。其功能性研究多限于哺乳动物膜结合TLRs的胞外区。在河豚和虹鳟中也发现了sTLR5。本文研究在感染灭鲑气单胞菌的大西洋鲑中的sTLR的核苷酸序列以及氨基酸序列，它与哺乳动物的TLR5相似，有21个LRR结构域，及LRR结构域中可能的配体识别位点。

从感染灭鲑气单胞菌的大西洋鲑的肝脏SSHcDNA文库中分离出了组装哺乳动物TLR5胞外域的3种EST克隆(Genebank：BQ036495，BQ036497，BQ036528)。这些不完整的TLR序列都小于600bp，编码不完整的TLR。为了获得TLR完整的编码区域，用RNeasy Maxi Kit从感染的大西洋鲑的肝脏中提取总RNA,用SMARTcDNA Library Construction Kit构建cDNA文库。用双重PCR扩增。第一重PCR：侧翼插入引物(5‘-CAACTTGAACAGCGTCTATCTAT-3‘)和pTriplEx引物(5‘-CGCCCTATAGTGAGTCGTA-3‘)，退火温度55℃，90s，40个循环。第二重PCR：基因特异性引物(5‘-GGGATATCAAGCATTTACAGGAC-3‘)和pTriplEx引物，退火温度58℃，45s，35个循环。对终产物进一步的测序，发现这种特别的TLR没有跨膜或胞质结构域。为得到5‘端的编码区，根据虹鳟的TLR5(AB062504)设计引物。用正向基因特异性引物(5‘-CAAGCTGTAAACACATTCTTTATG-3’)和反向引物(5’-CTCTATAGACATGTTTCTAAAC-3’)进行PCR扩增。扩增产物用TA cloning kit(Invitrogen)克隆进pCR2.1载体，再利用ABI PRISM BigDye Terminator Ready Reaction mix and Model 2700 PCR System Thermal进行PCR循环测序。蛋白质的BLASTX分析显示：其与哺乳动物对应的TLR5的胞外域有40%的相似性。

所得sTLR的cDNA序列全长2274bp，包括21bp的5‘非翻译区，1992bp的开放读码框，编码664个氨基酸残基，以及258bp的3‘非翻译区。前28个氨基酸残基构成一个单肽，其后富含脯氨酸的区域(图1下划线)以及富含亮氨酸(LRR)的重复区域。利用哺乳动物TLRs的LRR一致序列(xLxxLxLxxNx*xx*xxxxFxxLxxx，x代表任意氨基酸，*代表疏水的氨基酸)来鉴定大西洋鲑LRRs，发现其有21个LRR区域。C末端的序列是以一致的LRR结构域开始，其后是近50个氨基酸残基包括4个特殊构造的半胱氨酸残基xLxxLxLxxNxFxCxCx(24-26)Cx(18-21)C。大西洋鲑中的这种sTLR仅2个半胱氨酸残基是保守的。多数没有跨膜结构或TIR结构域的sTLR5也适用于这种情况。哺乳动物的mTLR5的四个半胱氨酸残基都用于维持C端的稳定性并保持整个胞外域靠近细胞膜。

LRR特征序列最初发现于人类血清基本结构，富含亮氨酸的α2糖蛋白，有24个氨基酸残基重复序列和特殊构造的疏水残基。大西洋鲑sTLR5含21个LRRs。除LRR7、9和18具有较大插入序列外，大西洋鲑sTLR的大多数LRRs组装与哺乳动物TLR-LRR是一致特征序列。在哺乳动物TLR4、5、7、8和9中，插入序列是常见现象，这对PAMP的识别是至关重要的。至今未知，LRR7、9和18的插入序列是否会影响大西洋鲑sTLR5配体结合微生物毒力因子。

与mTLR5s不同，这种特殊的sTLR5最早报道于河鲀基因组。它在与mTLR5不同染色体上的一个稀有基因编码的。在虹鳟中发现mTLR5和sTLR5有81%的相似性。用虹鳟肝瘤细胞系RTH-149，用鳗利斯顿氏菌或mTLR5的其他配体来刺激mTLR5，sTLR5的表达上调。人类TLR5的配体识别位点已定位于LRR特征序列，第386-407个氨基酸之间，LRR14中。鲑科鱼有6个独特的残基，至今未知这些序列是否与配体鞭毛蛋白识别的特异性相关。

若大西洋鲑LRR14能识别鞭毛蛋白，mTLR5和sTLR5将竞争性的结合配体，sTLR5可能被诱导为一种反馈调节机制来阻止对鞭毛蛋白的过量炎症反应。在小鼠的巨噬细胞系中，选择性的敲除可溶性mTLR4，有效阻止LPS介导的TNF-α的转导以及NF-κB的激活。在调节sTLR5介导的鞭毛蛋白的炎症反应中，正反馈和负反馈调节机制均存在。TLR5家族复杂的信号转导途径要等到配体结合位点确定后才能更加深入了解。

[1] Bell,J.K.,Mullen,G.E.,Leifer,C.A.,Mazzoni,A.,Davies,D.R.,Segal,D.M.,2003.Leucine-rich repeats and pathogen recognition in toll-like receptors.Trends Immunol.24(10),528-533.

[2] Takeda,K.,Kaisho,T.,Akira,S.,2003.Toll-like receptors.Annu.Rev.Immunol.21,335-376.456.

胡青(1991—)，女，汉族，湖北武汉人，研究生在读，西华大学外国语学院，研究方向：英语笔译。刘敏(1986—)，女，回族，江苏南京人，研究生在读，西华大学外国语学院，研究方向：英语笔译。

S917.4

A

1672-5832(2016)04-0281-01