微体系HRP浓度与其催化化学发光衰减率线性关系研究

杨子岩+梁平+汪钦+雷小英+卢兹凡+郭晏海+向安

[摘 要] 目的：了解微体系辣根过氧化物酶（HRP）催化化学发光与其浓度的相关性。方法：将HRP经核酸序列偶联于毛细管微腔内，通入微量反应底物进行化学发光检测；分析HRP催化化学发光反应与其浓度的相关性。结果：毛细管内HRP催化1.5μL底物的化学发光反应可分成急速衰减区（3.5×10-4～1.3×10-4μg/μL）、衰减延缓区（9.7×10-5～3.3×10-5μg/μL）和发光平稳区（1.0×10-5～6.7×10-7μg/μL）；浓度为3.5×10-4～6.7×10-6μg/μL的HRP催化化学发光衰减率RLUs/T>0且两者线性相关（R2=0.967）。结论：分析微体系HRP浓度与化学发光衰减率（RLUs/T）的线性相关性，为微体系HRP化学发光定量检测生物分子提供新策略。

[关键词] 微反应体系；辣根过氧化物酶；化学发光衰减；线性相关性

中图分类号：R331 文献标识码：A 文章编号：2055-5200（2014）01-001-05

Doi： 10.11876/mimt201401001

Linear relationship between concentration of HRP and its chemoluminescence decays in the micro-channel system YANG Zi-yan1，LIANG Ping2，WANG Qin2，LEI Xiao-ying2，LU Zi-fan2，GUO Yan-hai2，XIANG An2.（1. The second cadets team of Pharmacy School， the Fourth Military Medical University，710032；2. Department of Pharmacogenomics， School of Pharmacy， the Fourth Military Medical University；Institute of Gene diagnosis， PLA 710032）

[Abstract] Objective： Research the relationship between the concentration of horseradish peroxidase（HRP） and its chemiluminescence （CL） decays in micro-channel system. Method： Immobilize the HRP-streptavidin into a hydroxylation capillary， the micro-channel reaction system model in this study， with a single-stranded deoxyribonucleic acid （ssDNA） sequences that modify with biotin and amidogen. The relative luminescence units （RLUs） were being detected by a portable detector after injecting micro liter scale reaction substrates. Then the relationship between concentration of HRP and RLUs was been analysis through linear regression. Result： There were three RLUs characteristic regions， content rapidly decay in 3.5×10-4～1.3×10-4μg/μL， slowly decay in 9.7×10-5～ 3.3×10-5μg/μL and steady region of 1.0×10-5～ 6.7×10-7μg/μL， basic on the rate of decay of RLUs for different HRP concentration. Most important， the rate of decay of RLUs （RLUs/T） was linearly related to the concentration of HRP （3.5×10-4～6.7×10-6μg/μL， R2=0. 967）. Conclusion： The research of the linear relationship between concentration of HRP and RLUs/T afforded novel strategy for quantitative determination of biomolecules through chemiluminescent analysis in micro-channel system.

[Key words] micro-channel system； horseradish peroxidase （HRP）； chemiluminescence decays； linear relativity

前 言

微/纳米反应体系[1-2]辣根过氧化物酶（HRP）催化化学发光检测所需试剂/样品用量少、反应快且高效灵敏，在核酸[3]、抗原/抗体[4-6]等生物分子检测中应用广泛。由于微体系比表面积大、反应效率高、底物容量有限等因素，即使晖光型底物也会被快速消耗[7]。由此导致的化学发光衰减增加了微体系HRP浓度与化学发光强度的量效关系分析难度。新型反应底物/稳定剂[8]、流动注射进样[9]和快敏检测器[10-13]等研究虽在一定程度上提高了微体系HPR催化化学发光稳定性，但也增加了检测试剂成本和仪器价格。

为研究毛细管微体系内偶联HRP催化化学发光衰减趋势随HPR浓度的变化，首先将不同浓度HRP通过核酸序列偶联于毛细管微体系内；再加入反应底物后进行HRP催化学发光反应，检测其化学发光相对强度值（RLUs）；进而分析微体系内不同浓度HRP催化化学发光相对强度，及其衰减率（RLUs/T）与HRP浓度的相关性。最终为微体系化学发光定量检测生物分子提供新的分析策略。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料及仪器

链霉亲和素标记辣根过氧化物酶（碧云天生物技术有限公司，上海），化学发光反应底物（赛默飞世尔科技有限公司，美国），玻璃毛细管（华西医科大学（现四川大学医学院）仪器厂，成都），毛细管化学发光检测仪 （天隆科技有限公司/第四军医大学，西安），核苷酸连接臂（NH2-5-T10-3-biotin（生工生物工程有限公司，上海），3-氨基丙基三甲氧基硅烷、戊二醛等硅烷化试剂、硝酸溶液、氢氧化钠等化学试剂（SIGMA中国有限公司，北京），超纯水（Milli-Q Century超纯水系统，美国）。

1.2 实验方法和步骤

1.2.1 毛细管微体系内辣根过氧化物酶的固定 玻璃毛细管内壁羟基化、氨基化、醛基化处理后，经核苷酸序列（NH2-5-T10-3-biotin）将链霉亲和素-HRP固定于毛细管内壁。详细方法参照[14， 15]。1. 玻璃毛细管（长10.0cm，内径300μm）经HCl、NaOH处理进行羟基化；2. 经10%的3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTES）/甲苯溶液处理进行氨基化；3. 经10%戊二醛的磷酸缓冲液（PBS，pH7.0）进行醛基化处理；4. 检测端吸入20μM的5氨基/3生物素修饰寡核苷酸1.5μL（完成毛细管2cm区段标记），室温/避光水平放置24h；5. 以0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液和水溶液清洗，毛细管浸入5%脱脂牛奶磷酸缓冲液（PBS， pH7.2）于37℃封闭2h；6. 以1.5μL不同浓度链霉亲和素-HRP磷酸缓冲液（PBS， pH7.2）吸入毛细管标记端，放置30min，PBS清洗，48h内使用。

1.2.2 毛细管微体系内固定HRP催化化学发光 将偶联有不同浓度（3.5×10-4～6.7×10-7μg/μL）HRP的毛细管检测端吸入1.5μL现配化学发光底物A、B液等体积混合物，检测化学发光相对发光强度，并分析一定时期内RULs衰减率[（RLUs1-RLUs2）/（T1-T2），简写为RLUs/T]。

1.2.3 统计学分析 所有数据采用SPSS统计软件、Origin7.0科学绘图软件完成实验中相对发光值（RLUs）， RLUs/T分析，数据作图处理。

2 结果与讨论

毛细管微体系内不同浓度（3.5×10-4～6.7×10-7 μg/μL）HRP催化1.5μL底物化学发光相对强度（RLUs）可分成急速衰减区、缓慢衰减区和平稳区，具有不同RLUs衰减特征。

2.1 急速衰减区化学发光分析

2.2 衰减延缓区化学发光分析

毛细管微体系内浓度处于9.7×10-5～3.3×10-5μg/μL的HRP催化化学发光相对强度（RLUs）特征如图2。初始RLUs接近检测上限（9999 RLUs），经6min或更长时间衰减为零。与急速衰减区类似，无法从某时间点RLUs定量HRP浓度（图2a）。HRP浓度与化学发光衰减率（RLUs/T）明显线性相关（R2=0.948），如图2b。随着HRP浓度下降，单位时间消耗底物量开始下降，导致此区化学发光初始RLUs下降，反应期延长。为此出现不同浓度HRP化学发光RLUs变化出现交错。但HRP浓度与发光衰减率（RLUs/T）仍线性相关。

2.3 发光平稳区化学发光分析

毛细管微体系内浓度处于1.0×10-5～6.7×10-7μg/μL的HRP催化化学发光相对强度（RLUs）特征如图3。各浓度HRP初始RLUs和整个反应期的RLUs水平已有明显差异，发光反应6.5min后的RLUs并未如急速衰减区和延缓衰减区衰减为零，各浓度HRP的RLUs也未发生交错（图3a）。各浓度HRP化学发光衰减率（RLUs/T）如图3b， HRP>6.7×10-6μg/μL时，HPR催化化学发光衰减率（RLUs/T）与其浓度仍然具有线性相关性（R2=0.948）。HRP>6.7×10-6μg/μL，即RLUs/T>0，HRP催化化学发光RLUs具有衰减趋势（初始值 RLUsT0>反应期T1时RLUsT1）。RLUs/T≤0，HRP催化化学发光RLUs无变化或是有上升趋势，此时的RLUs/T与HRP浓度间无线性相关性。

2.4 全程化学发光衰减率分析

3 结论

微体系HRP化学发光分析具有试剂/样品用量少，反应迅速，检测灵敏度高等优势。在生物分子检测方面具有广阔应用前景。但受腔道容量限制，所能容纳的底物量十分有限。其化学发光反应衰减迅速，特别是较高浓度HRP情况下很难直接以发光强度值进行HRP定量分析。在前期研究基础上，本研究以毛细管微通道为微反应体系模型，模拟微体系HRP酶促化学发光定量检测偶联核酸序列浓度，通过分析毛微体系内不同浓度HRP催化化学发光衰减特征，发现HRP浓度与化学发光衰减率（RLUs/T）在较宽浓度范围具有线性相关性。 通过化学发光衰减率（RLUs/ T）定量检测HRP浓度，可有效解决直接基于化学发光强度进行微体系HRP定量检测范围窄，检测期短等缺点。其不足在于，如高浓度HRP催化化学发光RLU后期波动较大；化学发光衰减率需基于一定时期的RLUs差值与时间比值，因而增加了检测的复杂度，也降低了检测的时效性。但作为一种新的分析策略，它为微体系HRP化学发光分析在核酸、抗原/抗体等生物大分子定量检测方面提供新思路。

参 考 文 献

[1] LIU Y，LI Y.An antibody-immobilized capillary column as a bioseparator/bioreactor for detection of escherichia colio157：h7 with absorbance measurement[J].Analytical che mistry.，2001，73（21）：5180-5183.

[2] 王瑛.核酸的非同位素化学发光分析系统[J].生物工程进展，1995，（3）：18-24.

[3] Tracy Jordan，Lee Walus，Alex Velickovic，et al.A competitive chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of rmp-7 in human blood[J].J Pharm Biomed Anal，1996，14（12）：1653-1662.

[4] Bert Gold，DANIELA Radu，Alla Balanko，et al.Diagnosis of fragile x syndrome by southern blot hybridization using a chemiluminescent probe： a laboratory protocol[J].Molecular Diagnosis，2000，5（3）：169-178.

[5] NAKANO K，NAKAO T，SCHRAM K H，et al.Urinary excretion of modified nucleosides as biological marker of rna turnover in patients with cancer and aids.[J].Clin Chim Acta，1993，218（2）：169-83.

[6] DUFFY M J.Can molecular markers now be used for early diagnosis of malignancy？[J].Clin Chem，1995，41（10）：1410-3.

[7] Girotti S， Ferri E， Ghini S， et al. Direct quantitative chemiluminescent assays for the detection of viral DNA[J]. Analytica Chimica Acta， 1991， 255（2）：387-394.

[8] TSUKAGOSHI K，JINNO N，NAKAJIMA R.Development of a micro total analysis system incorporating chemiluminescence detection and application to detection of cancer markers[J].Analytical chemist ry.，2005，77（6）：1684-1688.

[9] BOWIE R A，ACHTERBERG P E，MANTOURA F C R，et al.Determination of sub-nanomolar levels of iron in seawater using flow injection with chemiluminescence detection[J].Anal Chim Acta，1998，361（3）：189-200.

[10] HUANG bo，LI Jianjun，ZHANG le，et al.On-line chemiluminescence detection for capillary ion analysis[J]. Anal Chem，1996，68（14）：2366-2369.

[11] Friesel， Milan，Baranowski， Bogdan，Lunden， Arnold. Pressure dependence of the transition to the proton conducting phase of cshso 4 ， cshseo 4 and rbhseo 4 studied by differential scanning calorimetry[J].Solid State Ionics，1989，35（1-2）：85-89.

[12] 李红梅，陈佳，徐斐，等.ELISA测定中TMB显色体系的优化及其稳定性研究[J].生物技术通报，2010，（2）：126-130.

[13] Manfred Renz ， Christina Ku.A colorimetric method for dna hybridization[J].Nucleic Acids Res.，1984，8（12）：3435-3444.

[14] Thomas P. Whitehead，Gary H. G. Thorpe，Timothy J. N. Carter，et al.Enhanced luminescence procedure for sensitive determination of peroxidase-labelled conjugates in immunoassay[J].Nature，1983，3（05）：158-159.

[15] Zhen Guo， Richard A. Guilfoyle， Andrew J. Thiel，et al.Direct fluorescence analysis of genetic polymorphisms by hybridization with oligonucleotide arrays on glass supports[J].Nucleic Acids Res.，1994，24（22）：5456-5465.

[16] 杨维平，章竹君. 固体表面发光法测定辣根过氧化物酶的研究[J]. 陕西师大学报：自然科学版，1995，23（2）：59-61.

参 考 文 献

[1] LIU Y，LI Y.An antibody-immobilized capillary column as a bioseparator/bioreactor for detection of escherichia colio157：h7 with absorbance measurement[J].Analytical che mistry.，2001，73（21）：5180-5183.

[2] 王瑛.核酸的非同位素化学发光分析系统[J].生物工程进展，1995，（3）：18-24.

[3] Tracy Jordan，Lee Walus，Alex Velickovic，et al.A competitive chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of rmp-7 in human blood[J].J Pharm Biomed Anal，1996，14（12）：1653-1662.

[4] Bert Gold，DANIELA Radu，Alla Balanko，et al.Diagnosis of fragile x syndrome by southern blot hybridization using a chemiluminescent probe： a laboratory protocol[J].Molecular Diagnosis，2000，5（3）：169-178.

[5] NAKANO K，NAKAO T，SCHRAM K H，et al.Urinary excretion of modified nucleosides as biological marker of rna turnover in patients with cancer and aids.[J].Clin Chim Acta，1993，218（2）：169-83.

[6] DUFFY M J.Can molecular markers now be used for early diagnosis of malignancy？[J].Clin Chem，1995，41（10）：1410-3.

[7] Girotti S， Ferri E， Ghini S， et al. Direct quantitative chemiluminescent assays for the detection of viral DNA[J]. Analytica Chimica Acta， 1991， 255（2）：387-394.

[8] TSUKAGOSHI K，JINNO N，NAKAJIMA R.Development of a micro total analysis system incorporating chemiluminescence detection and application to detection of cancer markers[J].Analytical chemist ry.，2005，77（6）：1684-1688.

[9] BOWIE R A，ACHTERBERG P E，MANTOURA F C R，et al.Determination of sub-nanomolar levels of iron in seawater using flow injection with chemiluminescence detection[J].Anal Chim Acta，1998，361（3）：189-200.

[10] HUANG bo，LI Jianjun，ZHANG le，et al.On-line chemiluminescence detection for capillary ion analysis[J]. Anal Chem，1996，68（14）：2366-2369.

[11] Friesel， Milan，Baranowski， Bogdan，Lunden， Arnold. Pressure dependence of the transition to the proton conducting phase of cshso 4 ， cshseo 4 and rbhseo 4 studied by differential scanning calorimetry[J].Solid State Ionics，1989，35（1-2）：85-89.

[12] 李红梅，陈佳，徐斐，等.ELISA测定中TMB显色体系的优化及其稳定性研究[J].生物技术通报，2010，（2）：126-130.

[13] Manfred Renz ， Christina Ku.A colorimetric method for dna hybridization[J].Nucleic Acids Res.，1984，8（12）：3435-3444.

[14] Thomas P. Whitehead，Gary H. G. Thorpe，Timothy J. N. Carter，et al.Enhanced luminescence procedure for sensitive determination of peroxidase-labelled conjugates in immunoassay[J].Nature，1983，3（05）：158-159.

[15] Zhen Guo， Richard A. Guilfoyle， Andrew J. Thiel，et al.Direct fluorescence analysis of genetic polymorphisms by hybridization with oligonucleotide arrays on glass supports[J].Nucleic Acids Res.，1994，24（22）：5456-5465.

[16] 杨维平，章竹君. 固体表面发光法测定辣根过氧化物酶的研究[J]. 陕西师大学报：自然科学版，1995，23（2）：59-61.

参 考 文 献

[1] LIU Y，LI Y.An antibody-immobilized capillary column as a bioseparator/bioreactor for detection of escherichia colio157：h7 with absorbance measurement[J].Analytical che mistry.，2001，73（21）：5180-5183.

[2] 王瑛.核酸的非同位素化学发光分析系统[J].生物工程进展，1995，（3）：18-24.

[3] Tracy Jordan，Lee Walus，Alex Velickovic，et al.A competitive chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of rmp-7 in human blood[J].J Pharm Biomed Anal，1996，14（12）：1653-1662.

[4] Bert Gold，DANIELA Radu，Alla Balanko，et al.Diagnosis of fragile x syndrome by southern blot hybridization using a chemiluminescent probe： a laboratory protocol[J].Molecular Diagnosis，2000，5（3）：169-178.

[5] NAKANO K，NAKAO T，SCHRAM K H，et al.Urinary excretion of modified nucleosides as biological marker of rna turnover in patients with cancer and aids.[J].Clin Chim Acta，1993，218（2）：169-83.

[6] DUFFY M J.Can molecular markers now be used for early diagnosis of malignancy？[J].Clin Chem，1995，41（10）：1410-3.

[7] Girotti S， Ferri E， Ghini S， et al. Direct quantitative chemiluminescent assays for the detection of viral DNA[J]. Analytica Chimica Acta， 1991， 255（2）：387-394.

[8] TSUKAGOSHI K，JINNO N，NAKAJIMA R.Development of a micro total analysis system incorporating chemiluminescence detection and application to detection of cancer markers[J].Analytical chemist ry.，2005，77（6）：1684-1688.

[9] BOWIE R A，ACHTERBERG P E，MANTOURA F C R，et al.Determination of sub-nanomolar levels of iron in seawater using flow injection with chemiluminescence detection[J].Anal Chim Acta，1998，361（3）：189-200.

[10] HUANG bo，LI Jianjun，ZHANG le，et al.On-line chemiluminescence detection for capillary ion analysis[J]. Anal Chem，1996，68（14）：2366-2369.

[11] Friesel， Milan，Baranowski， Bogdan，Lunden， Arnold. Pressure dependence of the transition to the proton conducting phase of cshso 4 ， cshseo 4 and rbhseo 4 studied by differential scanning calorimetry[J].Solid State Ionics，1989，35（1-2）：85-89.

[12] 李红梅，陈佳，徐斐，等.ELISA测定中TMB显色体系的优化及其稳定性研究[J].生物技术通报，2010，（2）：126-130.

[13] Manfred Renz ， Christina Ku.A colorimetric method for dna hybridization[J].Nucleic Acids Res.，1984，8（12）：3435-3444.

[14] Thomas P. Whitehead，Gary H. G. Thorpe，Timothy J. N. Carter，et al.Enhanced luminescence procedure for sensitive determination of peroxidase-labelled conjugates in immunoassay[J].Nature，1983，3（05）：158-159.

[15] Zhen Guo， Richard A. Guilfoyle， Andrew J. Thiel，et al.Direct fluorescence analysis of genetic polymorphisms by hybridization with oligonucleotide arrays on glass supports[J].Nucleic Acids Res.，1994，24（22）：5456-5465.

[16] 杨维平，章竹君. 固体表面发光法测定辣根过氧化物酶的研究[J]. 陕西师大学报：自然科学版，1995，23（2）：59-61.