选择性一维反式氢磷相关技术及在含磷化学毒剂分析中的应用

钟近艺+郑禾+崔燕

[摘 要] 采用整形脉冲和选择性激发技术，设计了一维磷选择性氢磷异核单量子相干（1H-31PHSQC）及多量子相干（1H-31PHMQC）脉冲序列，并以此为基础建立了相应检测方法。研究结果表明，选择性一维1H-31PHMQC技术比1H-31PHSQC灵敏度更高，可用于逐一分析和指认环境基质中的含磷化学毒剂。

[关键词] 氢磷相关；核磁共振；化学位移；耦合常数；化学毒剂

中图分类号：O657 文献标识码：A 文章编号：2055-5200（2014）01-009-04

Doi：10.11876/mimt201401003

The Application of Phosphorus-Selective 1H-31P Heteronuclear Coherence Technique on Detection of Organophosphorous Chemical Warfare Agents ZHONG Jin-yi1，2， ZHENG He2， CUI Yan2. （1.State Key Laboratory of NBC Protection For Civilian， Beijing 102205；2.Research Institute of Chemical Defence， Beijing 102205）

[Abstract] Introducing shaping pulses and selective excitation techniques， the Phosphorus-selective one-dimensional 1H-31P HSQC and HMQC were applied respectively to experiments. Compared to 1H-31P HSQC， application of the 1H-31P HMQC method resulted in more sensitive， and it is an effective technique for screening and identification of organophosphorus chemical warfare agents in environmental samples.

[Key words] 1H-31P heteronuclear multiple quantum coherence； NMR； Chemical shift； Coupling constant； Chemical warfare agent

引 言

在诸多的核磁共振技术中，选择性激发技术主要用于溶剂峰压制和核磁共振谱峰的精细结构研究[1]，但随着分析需求的不断提高，选择性激发技术在混合物分析中崭露头角[2-3]，特别是在结构相近化合物的分析中发挥了越来越重要的作用[4-5]，在化学毒剂的分析中也是如此[6]，神经性含磷化学毒剂由于其速杀性，一直是《禁止化学武器公约》监控的重点，但该类化合物在环境中易降解，因此降解产物也是核查的关键证据，但降解产物由于结构相近，氢谱谱峰之间重叠严重，仅用磷谱也难以区分。从结构上看，大多数神经性含磷化学毒剂的通式为：

其中，R1不仅是构成化学毒剂的关键元素，而且R1都具有共同的结构特征，即R1上与磷直接相连的氢核（或烷基氢/烷胺基氢）均与磷核发生耦合，虽然相隔两个化学键，耦合常数仍介于10～22Hz之间。环境基质的含磷背景干扰非常少，磷谱较为干净，即使存在含磷化合物的干扰，由于磷谱的化学位移范围较宽、谱线分辨率较好，一般不会出现谱峰之间的重叠，我们以此为选择性激发实验的突破口，通过磷磁化矢量的选择，建立磷选择性氢磷相关方法，以获取含磷化合物上磷氢核之间的连接关系，设计和实现了磷选择性一维反式氢磷相关脉冲序列，并首次成功将该技术用于水样中含磷化学毒剂降解产物的混合物分析中，解决了多种含磷化合物的逐一指认问题。

1 实验部分

1.1 样品制备

W0样品为含有4种有机烷基膦酸的水样，依次为甲基膦酸（MPA），乙基膦酸（EPA），丙基膦酸（PPA），异丙基膦酸（iPPA），这4种含磷化合物均为神经性毒剂的降解产物。浓度分别为380μg/ mL、362μg/mL、226μg/mL和312μg/mL。结构如图1所示。取0.5mLW0样品，用0.15mL重水（D2O）锁场。

图1 四种烷基膦酸结构

1.2 仪器与试剂

谱仪：Varian NMR System 600M核磁共振波谱仪，AutoXBB探头，1H共振频率为599.778MHz，31P的共振频率为240.0MHz，测试温度为298K，1H和31P的化学位移分别以DSS和H3PO4（85%）为外标。

试剂：实验中所用的氘代试剂均为美国CIL公司产品，氘代率不小于99.8%。1.3 实验参数

1H谱：脉冲序列为s2pul，45°激发脉冲角采集，谱宽6kHz，采样时间2.0s，弛豫延迟时间1s，谱图用指数窗函数进行加权（lb=1.0Hz）。

31P{1H}NMR谱：脉冲序列为s2pul，45°激发脉冲角采集，谱宽30kHz，弛豫延迟1s，采样时间2.0s，采用WALTZ组合脉冲进行质子去耦，谱图用指数窗函数进行加权（lb=1.0Hz）。

磷选择性一维1H-31PHSQC和1H-31PHMQC谱：均使用整形31P脉冲，偏置和带宽与所需选择性激发的磷峰相匹配，选择高斯整形脉冲。耦合常数JHP为 24Hz，延迟为梯度脉冲时间（1ms）和梯度恢复延迟时间（100μs）的总和，HSQC用于相干选择的梯度强度（g1，g2）为44.8和17.9g/cm，HMQC用于相干选择的梯度强度（g1，g2，g3）分别为28、12、0g/ cm，采样时间和弛豫延迟为1.0和2.0s，谱图在傅立叶变化前进行加权（lb=1.0）。

2 结果与讨论

2.1 选择性脉冲的实现

选择性激发主要是通过整形脉冲来实现。从傅立叶变换的角度考虑，由于整形脉冲和矩形脉冲的时域信号不同，经傅立叶变换后产生不同的频域图，即激发的频谱宽度不同，当选定一定形状的整形脉冲，并选定这种整形脉冲的宽度，即可确定所激发频谱的宽度，通过调整偏置来对准所选磷谱位置，最终实现对磷谱的选择性激发。

2.2 脉冲序列的实现

在脉冲序列的实现上，用选择性脉冲替代特定频率或区域的硬脉冲，固定延迟取代演化时间t1。选择性脉冲可分为180°脉冲和90°脉冲，对于给定的场强来说，选择性180°脉冲的选择性较相应的90°脉冲好，但可用于选择性激发的范围大大减少，我们通过对HSQC中的180°脉冲进行翻转，对HMQC中的90°脉冲进行选择性激发，设计了两种选择性激发脉冲序列，如图1和图2所示。为了减少31P选择性脉冲之后J耦合的演化，在选择性脉冲后不设梯度，以便选取180°质子脉冲以前的异核零量子相干以及此脉冲之后的双量子相干。按此方式，溶剂质子的磁化量被有效去相，只有与所选31P键直接相连的质子信号被保留。为了获取同相的多重峰，在最后的31P选择性脉冲后插入一个延迟。出于灵敏度的考虑，省略了延迟。

2.3 选择性一维反式氢磷相关脉冲序列测定W0的结果

图4是W0样品的氢谱，四种毒剂相关化合物的1H化学位移主要集中于0.8-1.9ppm，其中，化学位移1.31ppm的双峰为典型的甲基峰，从耦合常数上（17.4Hz）可以进一步确认其归属为甲基膦酸的甲基峰，由于4种化合物是以混合物形式存在，无法从积分面积获取质子间比例的信息，化学位移在1.80、1.58、1.48ppm的谱峰均显示AB体系裂分模式，这是由于其中的手性磷原子造成的，1.00ppm处的双二重峰可以直接指认为异丙基膦酸的Hb，0.90ppm的三重峰是丙基膦酸的Hc。

由于样品无背景干扰，我们可以采用同核相关技术（gCOSY）进行质子的归属，如图5所示，可以首先从1.00ppm和1.80ppm的相关确认异丙基膦酸的Ha（1.00ppm）和Hb（1.80ppm）；由0.84ppm和1.44ppm的相关、1.44ppm和1.58ppm的相关可以将这些质子明确指认为丙基膦酸的Ha（1.58ppm）、Hb（1.44ppm）、Hc（0.90ppm）。同样可以确定乙基膦酸的Ha（1.58ppm）和Hb（0.98ppm）。四种结构类似的烷基膦酸的磷谱见图6，四种有机磷化合物的化学位移分别为26.4ppm、28.9ppm、30.2ppm和 32.8ppm，仅凭化学位移无法确定四个磷谱峰的归属。图7是磷选择性一维1H-31P HSQC谱，从谱中可以看到，四种化合物的氢谱被一一分开，直接可以完成化合物的指认，多重峰的谱线强度比有些偏差，但是很容易获取谱峰的多重性和耦合强度信息。

参 考 文 献

[1] Duddeck H， Dietrich W， Toth G. Structure Elucidation by Modern NMR[M]. 1998.

[2] Nolis P， Gil S， Espinosa JF， et al. Improved NMR methods for the direct 13C-satellite-selective excitation in overlapped 1H-NMR spectra[J]. Magn Reson Chem， 2009， 47（2）： 121-132.

[3] Todica M， Fechete R， Blumich B. Selective NMR excitation in strongly inhomogeneous magnetic fields[J]. J Magn Reson Imagin， 2003， 164（2）： 220-227.

[4] Ghiviriga I. Selective excitation 1D-NMR for the assignment of the absolute configuration of secondary alcohols[J]. J Org Chem， 2012， 77（8）： 3978-3985.

[5] Rastrelli F， Schievano E， Bagno A， et al. NMR quantification of trace components in complex matrices by band-selective excitation with adiabatic pulses[J]. Magn Reson Chem， 2009， 47（10）： 868-872.

[6] Koskela H， Ullastiina H， Paula V. Structural characterization of chemical warfare agent degradation products in decontamination solutions with proton bandselective （1）H-（31）P NMR spectroscopy[J]. Anal Chem， 2010， 82（12）： 5331-5340.

2 结果与讨论

2.1 选择性脉冲的实现

选择性激发主要是通过整形脉冲来实现。从傅立叶变换的角度考虑，由于整形脉冲和矩形脉冲的时域信号不同，经傅立叶变换后产生不同的频域图，即激发的频谱宽度不同，当选定一定形状的整形脉冲，并选定这种整形脉冲的宽度，即可确定所激发频谱的宽度，通过调整偏置来对准所选磷谱位置，最终实现对磷谱的选择性激发。

2.2 脉冲序列的实现

在脉冲序列的实现上，用选择性脉冲替代特定频率或区域的硬脉冲，固定延迟取代演化时间t1。选择性脉冲可分为180°脉冲和90°脉冲，对于给定的场强来说，选择性180°脉冲的选择性较相应的90°脉冲好，但可用于选择性激发的范围大大减少，我们通过对HSQC中的180°脉冲进行翻转，对HMQC中的90°脉冲进行选择性激发，设计了两种选择性激发脉冲序列，如图1和图2所示。为了减少31P选择性脉冲之后J耦合的演化，在选择性脉冲后不设梯度，以便选取180°质子脉冲以前的异核零量子相干以及此脉冲之后的双量子相干。按此方式，溶剂质子的磁化量被有效去相，只有与所选31P键直接相连的质子信号被保留。为了获取同相的多重峰，在最后的31P选择性脉冲后插入一个延迟。出于灵敏度的考虑，省略了延迟。

2.3 选择性一维反式氢磷相关脉冲序列测定W0的结果

图4是W0样品的氢谱，四种毒剂相关化合物的1H化学位移主要集中于0.8-1.9ppm，其中，化学位移1.31ppm的双峰为典型的甲基峰，从耦合常数上（17.4Hz）可以进一步确认其归属为甲基膦酸的甲基峰，由于4种化合物是以混合物形式存在，无法从积分面积获取质子间比例的信息，化学位移在1.80、1.58、1.48ppm的谱峰均显示AB体系裂分模式，这是由于其中的手性磷原子造成的，1.00ppm处的双二重峰可以直接指认为异丙基膦酸的Hb，0.90ppm的三重峰是丙基膦酸的Hc。

由于样品无背景干扰，我们可以采用同核相关技术（gCOSY）进行质子的归属，如图5所示，可以首先从1.00ppm和1.80ppm的相关确认异丙基膦酸的Ha（1.00ppm）和Hb（1.80ppm）；由0.84ppm和1.44ppm的相关、1.44ppm和1.58ppm的相关可以将这些质子明确指认为丙基膦酸的Ha（1.58ppm）、Hb（1.44ppm）、Hc（0.90ppm）。同样可以确定乙基膦酸的Ha（1.58ppm）和Hb（0.98ppm）。四种结构类似的烷基膦酸的磷谱见图6，四种有机磷化合物的化学位移分别为26.4ppm、28.9ppm、30.2ppm和 32.8ppm，仅凭化学位移无法确定四个磷谱峰的归属。图7是磷选择性一维1H-31P HSQC谱，从谱中可以看到，四种化合物的氢谱被一一分开，直接可以完成化合物的指认，多重峰的谱线强度比有些偏差，但是很容易获取谱峰的多重性和耦合强度信息。

参 考 文 献

[1] Duddeck H， Dietrich W， Toth G. Structure Elucidation by Modern NMR[M]. 1998.

[2] Nolis P， Gil S， Espinosa JF， et al. Improved NMR methods for the direct 13C-satellite-selective excitation in overlapped 1H-NMR spectra[J]. Magn Reson Chem， 2009， 47（2）： 121-132.

[3] Todica M， Fechete R， Blumich B. Selective NMR excitation in strongly inhomogeneous magnetic fields[J]. J Magn Reson Imagin， 2003， 164（2）： 220-227.

[4] Ghiviriga I. Selective excitation 1D-NMR for the assignment of the absolute configuration of secondary alcohols[J]. J Org Chem， 2012， 77（8）： 3978-3985.

[5] Rastrelli F， Schievano E， Bagno A， et al. NMR quantification of trace components in complex matrices by band-selective excitation with adiabatic pulses[J]. Magn Reson Chem， 2009， 47（10）： 868-872.

[6] Koskela H， Ullastiina H， Paula V. Structural characterization of chemical warfare agent degradation products in decontamination solutions with proton bandselective （1）H-（31）P NMR spectroscopy[J]. Anal Chem， 2010， 82（12）： 5331-5340.

2 结果与讨论

2.1 选择性脉冲的实现

选择性激发主要是通过整形脉冲来实现。从傅立叶变换的角度考虑，由于整形脉冲和矩形脉冲的时域信号不同，经傅立叶变换后产生不同的频域图，即激发的频谱宽度不同，当选定一定形状的整形脉冲，并选定这种整形脉冲的宽度，即可确定所激发频谱的宽度，通过调整偏置来对准所选磷谱位置，最终实现对磷谱的选择性激发。

2.2 脉冲序列的实现

在脉冲序列的实现上，用选择性脉冲替代特定频率或区域的硬脉冲，固定延迟取代演化时间t1。选择性脉冲可分为180°脉冲和90°脉冲，对于给定的场强来说，选择性180°脉冲的选择性较相应的90°脉冲好，但可用于选择性激发的范围大大减少，我们通过对HSQC中的180°脉冲进行翻转，对HMQC中的90°脉冲进行选择性激发，设计了两种选择性激发脉冲序列，如图1和图2所示。为了减少31P选择性脉冲之后J耦合的演化，在选择性脉冲后不设梯度，以便选取180°质子脉冲以前的异核零量子相干以及此脉冲之后的双量子相干。按此方式，溶剂质子的磁化量被有效去相，只有与所选31P键直接相连的质子信号被保留。为了获取同相的多重峰，在最后的31P选择性脉冲后插入一个延迟。出于灵敏度的考虑，省略了延迟。

2.3 选择性一维反式氢磷相关脉冲序列测定W0的结果

图4是W0样品的氢谱，四种毒剂相关化合物的1H化学位移主要集中于0.8-1.9ppm，其中，化学位移1.31ppm的双峰为典型的甲基峰，从耦合常数上（17.4Hz）可以进一步确认其归属为甲基膦酸的甲基峰，由于4种化合物是以混合物形式存在，无法从积分面积获取质子间比例的信息，化学位移在1.80、1.58、1.48ppm的谱峰均显示AB体系裂分模式，这是由于其中的手性磷原子造成的，1.00ppm处的双二重峰可以直接指认为异丙基膦酸的Hb，0.90ppm的三重峰是丙基膦酸的Hc。

由于样品无背景干扰，我们可以采用同核相关技术（gCOSY）进行质子的归属，如图5所示，可以首先从1.00ppm和1.80ppm的相关确认异丙基膦酸的Ha（1.00ppm）和Hb（1.80ppm）；由0.84ppm和1.44ppm的相关、1.44ppm和1.58ppm的相关可以将这些质子明确指认为丙基膦酸的Ha（1.58ppm）、Hb（1.44ppm）、Hc（0.90ppm）。同样可以确定乙基膦酸的Ha（1.58ppm）和Hb（0.98ppm）。四种结构类似的烷基膦酸的磷谱见图6，四种有机磷化合物的化学位移分别为26.4ppm、28.9ppm、30.2ppm和 32.8ppm，仅凭化学位移无法确定四个磷谱峰的归属。图7是磷选择性一维1H-31P HSQC谱，从谱中可以看到，四种化合物的氢谱被一一分开，直接可以完成化合物的指认，多重峰的谱线强度比有些偏差，但是很容易获取谱峰的多重性和耦合强度信息。

参 考 文 献

[1] Duddeck H， Dietrich W， Toth G. Structure Elucidation by Modern NMR[M]. 1998.

[2] Nolis P， Gil S， Espinosa JF， et al. Improved NMR methods for the direct 13C-satellite-selective excitation in overlapped 1H-NMR spectra[J]. Magn Reson Chem， 2009， 47（2）： 121-132.

[3] Todica M， Fechete R， Blumich B. Selective NMR excitation in strongly inhomogeneous magnetic fields[J]. J Magn Reson Imagin， 2003， 164（2）： 220-227.

[4] Ghiviriga I. Selective excitation 1D-NMR for the assignment of the absolute configuration of secondary alcohols[J]. J Org Chem， 2012， 77（8）： 3978-3985.

[5] Rastrelli F， Schievano E， Bagno A， et al. NMR quantification of trace components in complex matrices by band-selective excitation with adiabatic pulses[J]. Magn Reson Chem， 2009， 47（10）： 868-872.

[6] Koskela H， Ullastiina H， Paula V. Structural characterization of chemical warfare agent degradation products in decontamination solutions with proton bandselective （1）H-（31）P NMR spectroscopy[J]. Anal Chem， 2010， 82（12）： 5331-5340.