LC-MS/MS 法测定前列地尔注射液中前列腺素A1

曹晴+刘志东+代文兵+张强

[摘 要] 目的：建立高效液相色谱-四极杆串联质谱联用法 （ LC-MS/MS 法） 测定前列地尔注射液中前列腺素A₁的含量。方法：前列地尔注射液经稀释后，采用Agilent.poroshell 120 SBC18色谱柱 （ 2.1×50 mm， 2.7 μm ） 进行分析，流动相为乙腈-0.5%甲酸水溶液，流速0.2 mL/ min；质谱采用电喷雾离子化 （ ESI ） 源，负离子-多反应监测 （ MRM ） 模式，内标法定量。结果：前列腺素A₁的线性范围为0.3～10 ng/mL ；平均回收率为100.2%，RSD为1.69%。3批样品每 1 mL中含前列腺素A₁均未过 3.0 μg。结论：该方法准确、简单、快速，可用于前列地尔注射液中前列腺素A₁的测定。

[关键词] 前列地尔注射液；前列腺素A₁；液质联用

中图分类号：o657 文献标识码：A 文章编号：2055-5200（2014）01-060-04

Doi：10.11876/mimt201401016

Determination of Prostaglandin A₁ in Alprostadil injection by LC-MS/MS CAO Qing1， LIU Zhi-dong1， DAI Wen-bing2， ZHANG Qiang2. （1.Research Center of Traditional Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193； 2.School of Pharmaceutical Sciences，Peking University， Beijing 100191）

[Abstract] Objective： To establish a liquid chromatography-tandem mass spectrometric method（LCMS /MS） for the determination of Prostaglandin A₁ in Alprostadil injection. Methods： After being diluted，the sample was separated on an Agilent.poroshell 120 SB-C18 column（2.1×50 mm 2.7 μm） for isocratic elution with a mobile phase of acetonitrile-0.5% formic acid water- solution at a flow rate of 0.2 mL/min.Then the processed sample was analyzed by tandem mass spectrometer with negativeelectrospray ionization（ESI） source，monitored under a multiple reaction monitoring（MRM） mode. Results： The calibration curve showed a good linearity in the range of 0.3 -10 ng/mL.The average recovery was 100.2% with RSD of 1.69%.The content of Prostaglandin A₁ in batches of Alprostadil injection samples was not more than 3.0 μg/mL. Conclusion： The developed method can be used for the quantitative determination of for Prostaglandin A₁ in Alprostadil injection.

[Key words] Alprostadil injection；compound；Prostaglandin A₁；LC-MS /MS

前列地尔是一种活性极强的内源性生理活性物质，具有明显的扩张血管、抑制血小板聚集，从而抑制血栓素A2的释放，它能特异性的作用于缺血局部，明显扩张病变狭窄的血管。在动物和临床研究中发现，该药可以降低血液粘度红细胞聚集性，改善血液流变学作用[1-2]。前列地尔在水溶液中化学稳定性差，对光、热、pH值敏感，前列地尔注射液在制备和储存过程中主要降解杂质为前列腺素A₁[3-4]。在前列地尔注射液质量标准[5] 中前列腺素A₁的含量测定方法为固相萃取、柱后衍生化高效液相色谱法，方法较复杂。关于前列腺素A₁的 LC-MS/MS测定方法目前尚未见报道。本研究首次建立了 LC-MS/MS 法测定前列地尔注射液中前列腺素A₁含量的方法，注射液经稀释后直接测定，操作简便。测定了3批前列地尔注射液中前列腺素A₁的含量，结果准确。该方法可为今后简单、方便地控制前列地尔注射液中前列腺素A₁的含量提供参考。

1 仪器与试药

LC-20AD 型高效液相色谱仪（日本 Shimadzu 公司） ；API 4000 三重四极杆质谱仪（美国 AB Sciex公司） ，配有电喷雾离子源；BT25S 电子天平（Sartorius）。

乙腈、甲醇均为色谱纯（德国 Merck 公司）；甲酸为色谱级（Formic Acid 99% HPLC，ROE scientific IAIC ，USA）；水为 Millipore 纯化水。

前列腺素A₁ 标准品（批号051M1421V，纯度≥98%，美国 Sigma 公司）、地塞米松标准品（纯度>99%，美国 Sigma 公司）。前列地尔注射液（凯时，北京泰德制药股份有限公司，规格：2 mL ： 10 μg）。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 标准储备液 精密称取前列腺素A₁标准品4 mg和内标地塞米松标准品10 mg，分别置10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成0.4 mg /mL的前列腺素A₁标准储备液和1 mg /mL的内标地塞米松标准储备液。

2.1.2 供试品溶液 精密量取前列地尔注射液50 μL和内标溶液 （5 μg /mL的地塞米松溶液） 200 μL置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 阴性样品溶液 按“2. 1. 2”项下方法制备不含前列地尔的阴性样品。

2. 2 色谱-质谱条件

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent.poroshell 120 SBC18（2.1×50 mm ，2.7 μm）；流动相：乙腈（A）-0.5%甲酸水溶液（B）（50：50，V/V）[6]；流速：0.2 mL/min；进样量：5 μL；柱温：26 ℃。

2.2.2 质谱条件 ESI 源：负离子扫描； MRM 模式，定量分析的离子反应分别：m/z 335.0 → m/z 317.1（前列腺素A₁）和m/z 391.0 → m/z 361.2（地塞米松，内标）；碰撞气压力（CAD）： 6.0 psi； 气帘气压力（CUR）：20 psi；雾化气压力（GS1） ： 40 psi； 去溶剂气压力（GS2） ： 50 psi； 去溶剂温度（TEM） ： 500 ℃； 喷雾电压（IS） ： -4500 V； 前列腺素A₁去簇电（DP） ： -34 V； 碰撞能（CE） ： -15 V；射入电压（EP） ： -10 V； 碰撞室出口电压（CXP） ： -6 V。地塞米松去簇电（DP） ： -90 V；碰撞能 （CE） ： - 14 V；射入电压（EP） ： -10 V； 碰撞室出口电压（CXP） ： -8 V。离子对驻留时间（Dwell） ： 100 ms。前列腺素A₁ 、地塞米松产物离子扫描质谱图，见图1。

在上述色谱-质谱条件下，流动相、对照品、阴性样品与样品图谱见图2。结果表明，前列地尔、辅料不干扰前列腺素A₁的测定，说明本LC-MS/MS条件下专属性良好，见图2。

2.3 线性关系

精密量取适量前列腺素A₁标准储备液和内标溶液（5μg /mL的地塞米松溶液） 200μL，分别置于10mL容量瓶中，以甲醇-水（50：50，v/v）稀释至刻度，摇匀，配制成浓度分别为 0.3，0.5，1，2，5，10ng/mL的前列腺素A₁系列标准溶液，分别取 5μL进行LC-MS/MS分析，并记录色谱图和数据；以前列腺素A₁浓度值为横坐标，以前列腺素A₁与内标的峰面积比值为纵坐标，用加权（W=1/x2）最小二乘法[7]回归运算得到直线回归方程，即为标准曲线：y=0.336x+0.00353 （r=0.9987）。前列腺素A₁在 0.3～10 ng/mL范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验

配制前列腺素A₁ 0.5、2、10 ng/mL 3个浓度的标准溶液，每个浓度平行3份，进样分析，得相应峰面积，结果前列腺素A₁低、中、高3个浓度峰面积的RSD分别为1.63%、1.10%、1.61%，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

取样品（批号2222M），依法制备供试品溶液，于制备好后 0、1、2、3、6 h 进样分析，并随行测定标准曲线，以标准曲线法计算前列腺素A₁的含量及其RSD，结果 RSD 为 3. 2%，表明供试品溶液在 0-6 h内稳定。

2.6 重复性试验

取样品 （批号2222M），一式 6 份，依法制备溶液并进样测定，随行测定标准曲线，以标准曲线法计算前列腺素A₁的含量及其RSD，结果平均含量为0.68μg/mL，RSD 为2.3%，表明方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

精密量取阴性样品（缺前列地尔） 50μL共9份，分别置10mL容量瓶中，分别加入适量前列腺素A₁标准溶液和内标溶液（5μg/mL的地塞米松溶液）200μL，然后用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制前列腺素A₁ 0.5、2、10ng/mL3个浓度的溶液，每个浓度平行3份，进样分析，得相应峰面积，结果平均回收率为100.2%，RSD为1.69%（见表1）。

2. 8 基质效应

取阴性样品 50μL，置10mL容量瓶中，分别精密加入适量前列腺素A₁ 对照品储备溶液和内标溶液（5 μg/mL的地塞米松溶液） 200μL，然后用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成浓度分别为 0.5、2、10ng/mL的前列腺素A₁溶液，进样分析，得相应峰面积； 取相应3个浓度的标准系列溶液与内标混合后直接进样分析，获得待测物无基质影响的峰面积，用待测物每一浓度经过两种处理方法所得的峰面积的比值计算本方法的基质效应。结果均在 90%～110%之间。表明在本方法下阴性样品基质对前列腺素A₁的测定无影响。

2.9 样品测定

取3批样品，依法制备供试品溶液，每批样品制备 3 份溶液，每份溶液进样测定 1 次，并随行测定标准曲线，以标准曲线法计算样品中前列腺素A₁的含量，并计算每批样品的平均含量，结果见表2。

3 讨论

前列腺素A₁为前列地尔注射液在制备和储存过程中主要降解杂质，已有文献报道的测定前列腺素A₁的方法多为高效液相色谱法[8-11]， 样品处理较为繁琐， 测定较为费时。本文采用灵敏度高，专属性强的高效液相色谱-四极杆串联质谱联用方法 （ LCMS/MS ） 测定，方法前处理简单快速，样品测定用时较短，灵敏度较高，检测限低，并且重现性较好，结果可靠准确，适合于前列地尔注射液的前列腺素A₁控制。

参 考 文 献

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